Introducción sobre la práctica:
El recuento de hematíes se realiza para determinar el número de eritrocitos presentes en un volumen determinado de sangre
( normalemente, en 1 mm cúbico de sangre ).
Materiales necesarios:
-Papel de filtro.
-Gradilla.
-Embudo de fitrado (en el caso de que el líquido de dilución de Hayem contenga precipitados ).
-Frasco lavador.
-Vaso de precipitado.
-Prepipeta.
-Microscopio óptico.
-Cubre.
-Tubos de ensayo.
-Pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos rojos (Perla de dentro del bulbo roja) o micropipeta.
-Puntas de micropipeta.
La que la tiene blanca es para el recuento de glóbulos blancos.
-Tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.
El que tiene la punta de color rojo es para recuento de glóbulos rojos y el de la punta blanca para el recuento de glóbulos blancos.
-Cámara de recuento de Neubauer mejorado.
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| Superior, campo claro e inferior, campo oscuro. |
Reactivos:
Se debe emplear un líquido de dilución que sea isotónico para evitar la alteración morfológica de los eritrocitos e incluso su lisis.
El que más se utiliza es el de Hayem, se compone de:
-2,5 g de Na2SO4 (Sulfato sódico).
-0,5 g de NaCl (Cloruro sódico).
-0,25 g de HgCl2 (Cloruro mercúrico).
-100 ml de agua destilada.
En el caso de que el líquido de dilución de Hayem contenga precipitados, debemos filtrar con el embudo.
Muestra:
Sangre capilar fresca o sangre venosa anticoagulada con EDTA.
Utilización de micropipeta en lugar de pipeta de Thoma:
Siempre debemos hacer una dilución: 1/100 si enrasamos hasta la señal de 1 o 1/200 si enrasamos hasta la señal de 0,5. (Normalmente dilución 1/100).
Si utilizamos 1ml de dilución = 1.000 microlitros:
1/100 = 0,01 ml = 10 microlitros de sangre.
1.000 microlitros totales - 10 microlitros de sangre = 990 microlitros de líquido de Hayem.
Una vez realizados los cálculos procedemos a la práctica:
Con una micropipeta depositamos 10 microlitros de la muestra de sangre en una tubo de ensayo y 990 microlitros de líquido de Hayem con otra punta de micropipeta. Por último agitamos la dilución.
Objetivos de esta práctica:
-Contar el número de eritrocitos que hay en un determinado volumen de sangre, necesitamos la ayuda de la cámara de recuento de Neubauer, un cubre y un microscopio óptico.
-Saber qué hacer si el líquido de Hayem contiene precipitados.
-Determinar cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre cada uno de los cuadrados pequeños donde se han contado los eritrocitos.
-Decir cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre cada uno de los cuadrados medianos donde se han contado los eritrocitos.
-Determinar el volumen de sangre diluida que hay sobre el cuadrado central.
-Si la pipeta de Thoma se enrasa con sangre hasta la señal de 1, ¿cuál es la dilución posteriormente obtenida?.
-Si la sangre se diluye a 1/200 y se cuentan 450 eritrocitos en 5 cuadrados medianos, ¿cuál es el RBC obtenido?.
Desarrollo de la práctica:
1. Primero hay que situar el cubre sobre el retículo de la cámara de Neubauer ejerciendo una pequeña presión a la vez que se desliza el cubre sobre las bandas laterales habiendolas humedecido con agua destilada.
2. Aspirar con la pipeta de Thoma unida al tubo de goma con boquilla (El tubo está unido a una prepipeta) hasta la señal de 1 (para saber si hay anemia).
En el caso de que nos hayamos pasado al enrasar hay que hacer descender la columna de sangre tocando la punta de la pipeta de Thoma con un algodón o gasa.
3. Limpiar bien el exterior de la pipeta con cuidado y aspirar el líquido de Hayem (que hemos depositado previamente en un vaso de precipitado) hasta la señal de 101.
4. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta de Thoma y homogeneizar el contenido del bulbo. Hay que sujetar la pipeta de Thoma por sus extremos , con los dedos pulgar e índice, agitando suavemente en sentido horizontal durante aproximadamente 2-3 minutos.
5. Después hay que desechar las tres primeras gotas emitidas por la pipeta.
6. Depositar la siguiente gota entre la cámara de recuento de Neubauer y el cubre.Se realiza poniéndola en uno de los bordes no adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas estructuras.Hay que evitar la formación de burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre.
7. Dejamos reposar durante unos minutos para que las células presentes en ella puedan sedimentarse.
8. Ya podemos observar al microcopio óptico con el objetivo de 40 x y con el condensador a baja altura.
Interpretación de los resultados:
Hay que contar los 5 cuadrados medianos ( 4 de las esquinas y 1 central) y para evitar contar repetidamente los mismos eritrocitos, solo se cuentan los que están contenidos dentro del cuadrado y los que están en contacto con sus líneas de demarcación superior o derecha.
El libro aconseja que se siga el orden de "zig-zag" a la hora de contar los eritrocitos.
Hemos contado un total de 481 eritrocitos en los 5 cuadrados.
Para calcular el número de eritrocitos vamos a emplear la siguiente fórmula:
RCB = H x 5 x 10 x D.
-RCB, es el recuento de hematíes ( número de hematíes por mm cúbico de sangre ),la "H" es el número de
hematíes contados en los 5 cuadrados medianos.
-Se multiplica por 5 ya que el cuadrado grande central tiene 25 cuadrados medianos ( se hace esto para calcular el nº de hematíes en el cuadro central grande ).
- Después se multiplica por 10 porque la longitud del cuadrado grande central es de 1mm y la longitud del espacio entre éste y el cubre es de 0,1 mm y queremos el nº de hematíes en 1mm cúbico, no en 0,1 mm cúbicos.
-A continuación hay que multiplicar por 100 debido a que hemos partido de que en la pipeta de Thoma hemos enrasado con sangre hasta 1 (para saber si hay anemia), si queremos saber si hay policitemia se multiplica por 200 y se enrasa hasta la línea de 0,5. Hemos hecho una dilución: 1/100
-Finalmente, se multiplica por "D" , que es el factor de dilución.
Antes de proceder a hacer los cálculos, hay que recordar que el margen de error de esta técnica es alto ( es de +20 o -20 % ).
Cálculos:
RCB = 481 x 5 x 10 x 100 = 2.405.000 / mm cúbico de sangre.
Interpretación de la cantidad obtenida:
Se considera normal un recuento de hematíes (RBC) comprendido entre los 4 y los 5,5 millones / mm cúbico en las mujeres, y entre los 4,5 y los 6 millones / mm cúbico en los hombres.
Hemos obtenido un RBC de 2.405.000 / mm cúbico de sangre, está muy por debajo de la media, por lo que posiblemente la sangre que hemos utilizado ( sangre venosa anticoagulada ) no se encuentre en las mejores condiciones.
RESOLUCIÓN DE LOS OBJETIVOS PROPUESTOS:
- Si el líquido de Hayem contiene precipitados hay que filtrarlo.
- V= l x l x h = 0,0625 mm x 0,0625 mm x 0,1 mm = 0,000390625 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado pequeño periférico y V= l x l x h = 0,05 mm x 0,05 mm x 0,1 mm = 0,00025 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado pequeño central.
-V= l x l x h = 0,25 mm x 0,25 mm x 0,1 mm = 0,00625 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado mediano periférico y V= l x l x h = 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm = 0,004 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado mediano central.
- V= 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm cúbicos.
- La dilución posteriormente obtenida si la pipeta de Thoma se enrasa hasta la señal de 1 es de 1 / 100.
-Si la sangre se diluye a 1 / 200 y se cuentan 450 eritrocitos en 5 cuadrados medianos el RBC es:
RBC = 450 x 5 x 10 x 200 = 4.500.000 / mm cúbico de sangre.
En este caso el RBC ha dado un resultado que puede considerarse válido, ya que, el valor está dentro de la media.
VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Sexo de la persona a la que pertenece la sangre:
-Femenino.
El RBC obtenido es:
-Bajo.
Bibliografía:
-www.omelsnlozaa.blogspot.com
-www.marienfeld-superior.blogspot.com
-www.rsulab.mx
-www.ugr.es
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