Práctica: Cálculo de los índices eritrocitarios.

Fecha: 26/01/2015.


Introducción sobre la práctica:

Se denominan índices eritrocitarios primarios al hematocrito (HTO), al recuento de hematíes (RBC) y a la concentración de hemoglobina (Hb).


A partir de ellos podemos obtener los índices eritrocitarios secundarios, que son: el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH o CHCM).


Desarrollo de la práctica:

Como para calcular los índices eritrocitarios necesitaremos el hematocrito, el recuento de hematíes y la concentración de hemoglobina, vamos a realizar cada práctica por separado.


(Debemos recordar que las 3 prácticas que vamos a realizar están ya hechas en prácticas anteriores y explicadas de forma más detallada).


1º Recuento de hematíes (RBC):

Breve explicación de la práctica:

El recuento de hematíes o RBC consiste en determinar el número de eritrocitos presentes en un volumen determinado de sangre (normalmente, en 1mm cúbico de sangre).

Material necesario:

-Pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos rojos o micropipeta.

-Tubo de goma con boquilla.

-Cámara de recuento de Neubauer.

-Papel de filtro.

-Frasco lavador.

-Cubreobjetos.

-Microscopio.

-Prepipeta.

-Vaso de precipitado.


Reactivos:

-Líquido de dilución de Hayem.

-Agua destilada.


Muestra:

Utilizamos sangre venosa anticoagulada con EDTA.


Procedimiento de la práctica:

1. Situamos el cubre sobre el retículo de la cámara de Neubauer, humedecido previamente con agua destilada para que se adhiera mejor.

2. Aspiramos la sangre hasta la línea de 1 ,con la pipeta de Thoma para glóbulos rojos (también se puede hacer con micropipeta) unida al tubo de goma y éste a su vez unido a una prepipeta.

3. Después, aspiramos el líquido de Hayem hasta la señal de 101.



4. Homogeneizamos el bulbo agitando suavemente de 2 a 3 minutos.

5. Desechamos las tres primeras gotas  y depositamos la siguiente gota en el espacio entre el cubre y la cámara de Neubauer para que penetre por capilaridad.

6. Dejar reposar unos minutos y ya se puede observar al microscopio.




7. Enfocar el retículo con el objetivo de 40 x y con el condensador a baja altura.



8. Contar los hematíes presentes en los 4 cuadrados medianos de las esquinas y en el del centro.

Cálculos para obtener el recuento de hematíes (RBC):

RBC= H x 5 x 10 x D.


RBC= recuento de hematíes.

H= hematíes contador en los 5 cuadrados medianos.

D= factor de dilución (100 porque hemos enrasado hasta la señal de 1 con la sangre).


RBC = 947 x 5 x 10 x 100 = 4,7 millones / mm cúbico de sangre.



Interpretación clínica de los resultados:

Hemos obtenido 4,7 millones / mm cúbico de sangre, se considera un valor normal tanto en hombres como en mujeres, porque está comprendido entre los 4 y los 5,5 millones / mm cúbico de sangre en mujeres, y entre los 4,5 y 6 millones / mm cúbico en hombres.


2º Hematocrito (HTO):

Breve explicación de la práctica:

Cuando se centrifuga la sangre, la fracción forme, que contiene los hematíes, se agrupa en el fondo del tubo, y el plasma queda en forma de sobrenadante.


El hematocrito (HTO) es la relación existente entre el volumen ocupado por los hematíes y el ocupado por la sangre total, expresada en forma de porcentaje.


Material necesario:

-Capilares heparinizados o no heparinizados.

-Plastilina.

-Papel de filtro.

-Gasas.

-Lanceta.

-Centrífuga de microhematocrito.

-Lector de microhematocrito o regla milimetrada.


Reactivos utilizados:

Utilizamos capilares heparinizados.


Muestra:

Empleamos sangre capilar, desechamos la primera gota obtenida tras la punción.


Procedimiento:

1. Se debe hacer la determinación por duplicado, porque hay que enfrentar los capilares dentro de la centrífuga de microhematocrito.



2. Llenar cada capilar con sangre hasta las 3/4 partes de su longitud.



3. Limpiar el exterior del capilar con una gasa.



4. Sellar el extremo de cada capilar con plastilina. Para ello, se hace penetrar el capilar en la plastilina.



5. Colocar en la cenrífuga de microhematocrito los capilares enfrentados.



6. Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 minutos.

7. Por último, para calcular el resultado utilizamos el lector de microhematocrito porque es más rápido, aunque también se puede hacer con una regla milimetrada empleando una determinada fórmula. 


(En prácticas anteriores explico detalladamente las dos formas de calcular el hematocrito, con lector de microhematocrito y con regla milimetrada).


8. Tan solo hay que colocar el capilar en la ranura, con la columna de eritrocitos hacia el punto rojo y girar el disco central hasta hacer coincidir:

-La línea más alejada del punto rojo, con el final de la columna de plasma.

-La línea más cercana al punto rojo, con el inicio de la columna de eritrocitos.

-La línea central, con la interfase de separación presente entre el plasma y los eritrocitos.


Interpretación clínica de los resultados:

Obtuvimos un hematocrito del 45% y otro del 46 %, se encuentran dentro de los valores normales tanto en mujeres ( entre el 42 y el 45 %) y en hombres / entre el 45 y el 52%).


Entre los dos capilares no hubo una diferencia de más del 2 %, por lo tanto, no hubo que realizar la determinación otra vez ni hacer la media de los dos valores ( si al hacer la media salía un HTO mayor del 50% se repetía la centrifugación alargándola a 10 minutos).


3º Determinación de la concentración de hemoglobina (Hb) en sangre:

Breve introducción sobre la práctica:

Determinar la hemoglobina en sangre es esencial para le diagnóstico de las anemias.


Existen distintos métodos para determinarla, los más utilizados se fundamentan en la capacidad para absorber luz de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como la oxihemoglobina o la cianmetahemoglobina.



La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.


Material necesario:


-Papel de filtro.


-Gradilla.


-Tubos de ensayo.


-Frasco lavador.


-Pipetas Pasteur.


-Micropipeta.


-Puntas de micropipeta.


-Pipetas graduadas.


-Cronómetro.


-Cubetas para espectrofotómetro.

-Espectrofotómetro.

Reactivos:


-Preparar el reactivo de trabajo (RT):


Poner 5 ml de cianuro de potasio en un matraz aforado de 250 ml y enrasar con agua destilada hasta la línea de aforo.

-Patrón de hemoglobina.

Muestras utilizadas:


Nosotros utilizamos sangre venosa anticoagulada con EDTA, pero como hacían falta dos muestras, utilizamos sangre de distintas bolsas.


Procedimiento de la práctica:


1. Rotulamos 5 tubos de ensayo como Blanco de reactivo, Patrón , muestra 1y muestra 2.




2. En el tubo rotulado Blanco, le añadimos con ayuda de una pipeta graduada 2,5 ml de Reactivo de trabajo (RT).




3. En el tubo rotulado Patrón, le añadimos con ayuda de una pipeta graduada 2,5 ml de Reactivo de trabajo (RT) y con una micropipeta también le añadimos 10 microlitros de Patrón para hemoglobina.




4. A continuación, en el tubo de ensayo rotulado como muestra 1, ponemos 10 microlitros de la primera sangre escogida y 2,5 ml de Reactivo de trabajo (RT).




5. Después, en el tubo rotulado como muestra 2, hacemos lo mismo que para la muestra 1 pero con la segunda sangre escogida.




6. Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente.

7. Por último utilizaremos el espectrofotómetro para calcular la absorbancia del Patrón y de las muestras 1 y 2.


Para calibrar el espectrofotómetro debemos hacerlo diluyendo primero a 1/2 y después a 1/4,  añadiendo en un tubo de hemólisis 250 microlitros de patrón de hemoglobina (15g/dl), en el segundo tubo añadiendo 250 microlitros de patrón anterior y 250 microlitros de agua destilada (7,5 g/dl) y en el  tercer tubo añadiendo 250 microlitros del tubo anterior y 250 microlitros de agua destilada (3,75 g/dl).


Haciendo todo esto hemos sacado el patrón 1, 2 y 3 , nos servirá en la gráfica de la absorbancia para calcular la concentración de hemoglobina del patrón y de las muestras 1 y 2.


Podemos hacerlo en microlitros o en ml:

250 microlitros = 0,25 ml


De patrón para calibrar hacemos un total de 0,5 ml = 500 microlitos


Para utilizar el espectrofotómetro deberemos aprender la hoja sobre su manejo.

(El Blanco es solo para calibrar el aparato)

Resultados obtenidos:

Con el espectrofotómetro obtuvimos los siguientes resultados:

Patrón: A540 = 0,283

Muestra 1: A540 = 0,303

Muestra 2: A540 = 0,265

Empleando la siguiente fórmula calculamos la concentración de hemoglobina de la muestra 1 y 2:

 (  (A) Muestra 1 o 2 / (A) Patrón ) x 15 


- (A) = Absorbancia de la muestra 1

- 15 = Concentración de hemoglobina del Patrón = g/dl.


Muestra 1: (0,303 / 0,283) x 15 = 16 g/dl.

Muestra 2: (0,265 / 0,283) x 15 = 14 g/dl.

Interpretación clínica de los resultados:

Los valores normales son:

Hombres: 14-18 g/dl.

Mujeres: 11-16 g/dl.

Niños: 10-14 g/dl.


 Nos ha salido: 16 g/dl en la muestra 1 y 14 g/dl en la muestra 2, por lo que son valores normales dentro de un adulto.


Si nos hubieran salido unos valores por debajo de los valores normales: indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.


Por encima de los valores normales: puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.



Objetivos de la práctica:

-Con los datos siguientes, calcular el VCM, HCM y CHCM.

HTO = 41,8 %.
Hb = 14,5 g/dl.
RBC = 4,86 millones / mm cúbico de sangre.


Procedimiento de la práctica:

Una vez obtenidos los tres parámetros necesarios, podemos proceder a realizar los cálculos.

RBC = 4,7 millones / mm cúbico de sangre.
HTO = 45 % (por ejemplo, la del primer capilar).
Concentración de hemoglobina (Hb) = 16 g/dl ( por ejemplo, la de la muestra 1).

1. Lo primero que necesitamos es calcular el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración corpuscular media de Hb (CHCM).

-VCM = (HTO/ RBC) x 10 

VCM = (45/4,7) x 10 = 95,74 fl.

-HCM = (Hb/ RBC) x 10 

HCM = (16/4,7) x 10 = 34 pg.

-CHCM = (Hb/HTO) x 100

-CHCM = ( 16/45) x 100 = 35,5 g/dl.


Interpretación clínica de los resultados:

El volumen corpuscular medio (VCM) se encuentra dentro de  los valores normales, entre 80 y 100 fl.


La hemoglobina corpuscular media (HCM) nos sale 34 pg, por lo que, es un poco superior a los valores normales: entre 27 y 31 pg.
En este caso, estamos hablando de una hipercromía. 


Las concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)  se encuentra dentro de los valores normales: entre 32 y 36 g/dl.


Resolución de los objetivos propuestos:

-Tenemos que calcular el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM).

Datos:

HTO = 41,8 %.
Hb = 14,5 g/dl.
RBC = 4,86 millones / mm cúbico.

Cálculos:

-VCM = (HTO/RBC) x 10

VCM = (41,8/4,86) x 10 = 86 fl.

-HCM = (Hb/RBC) x 10

HCM = (14,5/4,86) x 10 = 29,83 pg.

-CHCM = (Hb/HTO) x 10

CHCM = (14,5/41,8) x 10 = 3,47 g/dl.


Interpretación clínica de los resultados:

El volumen corpuscular medio (VCM) se encuentra dentro de los valores normales: entre 80 y 100 fl.


La hemoglobina corpuscular media (HCM) también se encuentra dentro de los valores normales: entre 27 y 31 pg.


La concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) no se encuentra dentro de los valores normales, porque nos sale 3,47 g/dl y los valores normales están muy por encima, entre 32 y 36 g /dl.
En este caso hay una hipocromía, se suele dan en la hidrocitosis o estomatocitosis congénita, por dilución del contenido hemoglobínico eritrocitario.


Bibliografía:

-www.biolog.infl.com

-www.materialeshem.net

-www.laboratoriohk.es

-www.hembio.blogspot.com