Práctica: Estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes.

Fecha: 25/02/2015.


Introducción sobre la práctica:

El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. 


Para ello, se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de Cloruro de Sodio (NaCl) cuya concentración es decreciente (soluciones hipotónicas).


Cuando los hematíes están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los eritrocitos , una parte de la Hb que contienen puede salir al exterior a través de los poros de sus membrana. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis).


Esta prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de su contenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE).


Dentro de una misma sangre, la ROE de los hematíes varía de unos a otros.


Aclaración de conceptos:


-Solución hipotónica: la concentración  fuera del eritrocito es menor que la que hay dentro de él.


-Solución isotónica: la concentración  fuera del eritrocito es igual a la concentración dentro de él.


-Solución hipertónica: la concentración fuera del eritrocito es mayor que la concentración dentro de él.

Material necesario:

-Papel de filtro.

-Reloj.

-Centrífuga.

-Rotulador de vidrio.

-Tubos de ensayo.

-Tubos de ensayo para centrífuga (cónicos).

-Papel Parafilm.

-Gradilla.

-Pipetas Pasteur de vidrio.

-Vaso de precipitado.

-Frasco lavador.

-Cubetas de espectrofotómetro.

-Espectrofotómetro.

Reactivos:

-Suero fisiológico: lo teníamos al 0,9% y le añadimos 2,7 g de fosfato sódico di-básico (Na2HPO4. 12 H20).

Suero fisiológico al 0,9 %

2,7 g de fosfato sódico di-básico

Lo pusimos en un agitador
para que se disolviese bien.

-Agua destilada.


Muestra:

-Sangre venosa anticoagulada con heparina.


Objetivos de la práctica:

-Saber qué concentración de NaCl tiene el suero fisiológico.


-Decir en qué porcentaje se puede incrementar normalmente el volumen de los hematíes sin que éstos se rompan.


-Decir la sustancia se emplea para anticoagular la sangre en esta prueba.


-Saber cuál es la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones en esta prueba.


-Decir a qué concentración salina suele producirse una hemólisis del 50 % en condiciones normales.


-Saber en qué enfermedades se produce una disminución de la ROE.


Desarrollo:

1. Preparamos la batería de soluciones de cloruro de sodio (NaCl), a concentraciones decrecientes:

En en libro ponen que son 18 tubos, para no hacer tanto, en un primer momento decidimos utilizar 9, finalmente decidimos utilizar 8 para que en la centrífuga estuviesen compensados. (Los tubos que escogimos fueron salteados: 1, 3, 7, 9,11, 13, 15 y 17).


2. Seguimos las instrucciones de la tabla anterior y realizamos los 8 tubos con las cantidades de agua destilada y de suero fisiológico indicadas en cada caso.


3. Añadimos a cada tubo 1 gota de sangre muestra con ayuda de una pipeta Pasteur.


4. Agitamos suavemente los tubos sin utilizar agitador, ya que, puede hemolizar la sangre.



5. Los dejamos en reposo, 30 minutos a temperatura ambiente.

6. Centrifugar los tubos a 2.000 rpm durante 5 minutos.


Lectura de resultados:

Puede ser visual o espectrofotométrica. En ambos casos, lo que se valora es la presencia o la ausencia de hemólisis en los tubos.


Si la lectura es visual, se considera que no hay hemólisis cuando en el tubo se observa un sedimento en forma de botón rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. Sin embargo, se estima que hay una hemólisis parcial cuando se advierte la presencia de un botón sedimentario, pero que se acompaña de un sobrenadante rojizo y transparente. Y , finalmente, se considera que la hemólisis es total cuando sólo se aprecia la existencia de un líquido rojizo y transparente.


Para realizar la lectura espectrofotométrica, se recoge de forma separada el líquido contenido en todos los tubos, y se mide la absorbancia (A) de cada uno de ellos, en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 540 nm.


El blanco va a ser el tubo nº 1, ya que al haber sido éste elaborado a partir de una solución de cloruro de sodio (NaCl) a una concentración de 9 g/l, se supone que la hemólisis debe de haber sido nula y, por tanto, que la absorbancia media en él no ha de ser valorada.


En este caso utilizamos el espectrofotómetro introduciéndole las cubetas, la única diferencia con respecto a como lo hacíamos en prácticas anteriores es que no hay que pulsar "Pump" al introducir cada tubo, sino "Enter" ni tampoco hay que limpiar el tubito exterior.


Los demás pasos son iguales:

Hay que recordar que la cubeta debe colocarse de la forma que indica la flecha y que solo debe tocarse por la parte rugosa, en caso contrario influirá en las mediciones.


También conviene saber que en este caso podemos utilizar la misma pipeta y la misma cubeta para todos los tubos si vamos midiendo de menor a mayor concentración. ( Podemos hacerlo porque estamos midiendo la misma sustancia, si fueran distintas sustancias no se puede ).


Resultados obtenidos:

(A) Blanco = 0

(A) Tubo nº 3 = 0,018

(A) Tubo nº 7 = 0,153

(A) Tubo nº 9 = 0,579

(A) Tubo nº 11 = 0,983

(A) Tubo nº 13 = 1,042

(A) Tubo nº 15 = 1,099

(A) Tubo nº 17 = 1, 156


Los resultados espectrofotométricos de cada tubo se ofrecen en forma de porcentaje de hemólisis. Para ello, se considera que la absorbancia medida en el líquido nº 17 corresponde a un 100 % de hemólisis, ya que al haber sido preparado con la solución más hipotónica, debe ser el más hemolizado. Por tanto, el porcentaje de hemólisis que corresponde a cada tubo se calcula con la siguiente fórmula:


Cálculos:

% de hemólisis = A / AM  x 100


A = Absorbancia del líquido presente en el tubo analizado.

AM = Absorbancia del líquido contenido en el tubo nº 17 ( A máxima).


-Tubo nº 1:


% de hemólisis = 0 / 1,156 x 100 = 0 %


-Tubo nº 3:


% de hemólisis = 0,018 / 1,156 x 100 = 1,56 %


-Tubo nº 7:


% de hemólisis = 0,153 / 1,156 x 100 = 13,23 %


-Tubo nº 9:


% de hemólisis = 0,579 / 1,156  x 100 = 50,08 %


-Tubo nº 11:


% de hemólisis = 0,983 / 1,156 x 100 = 85,03 %


-Tubo nº 13:


% de hemólisis = 1,042 / 1,156 x 100 = 90,14 % 


-Tubo nº 15:


% de hemólisis = 1,099 / 1,156 x 100 = 95,07 %


-Tubo nº 17: 


% de hemólisis = 0,977 / 0,977 x 100 = 100 %



Interpretación clínica de los resultados:

En condiciones normales, debe apreciarse visualmente una hemólisis parcial clara a partir del tubo nº 10 (el preparado con solución salina a 4,5 g/l) y una hemólisis prácticamente total a nivel de los tubos nº12, nº13  o nº 14 (los que contienen, respectivamente, solución salina a 3,5 ; 3 y 2,5 g /l ).


Generalmente, el 50 % de hemólisis se produce a nivel de los tubos 10 u 11 (los que contienen, respectivamente, solución salina a 4,5 y 4 g /l).


Cuando la ROE es baja: aumenta la hemólisis en los tubos que contienen solución salina a mayor concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en al eliptocitosis u ovalocitosis congénita y en la estomatocitosis hereditaria, debido a que en estas enfermedades la superficie de los hematíes está disminuida con respecto a su volumen, por lo que éstos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmótica.


Cuando la ROE sube, la aparición de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solución salina a una concentración menor que lo previsto. Esto acontece con los reticulocitos y con los glóbulos rojos propios de la talasemia minor y de la anemia ferropénica, debido a que estas células tienen incrementada su superficie en relación con su volumen, por lo que toleran mejora la entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osmótica.


Resolución de los objetivos propuestos:

- La concentración de NaCl que tiene el suero fisiológico es de 9 g/l.


- Normalmente, se puede incrementar el volumen de los hematíes sin que éstos se rompan  hasta un 70 %.


-Para anticoagular la sangre en esta prueba se emplea heparina.


-En esta prueba, la concentración salina menor a la que se preparan las soluciones es a 0,5 g/l.


-En condiciones normales, suele producirse una hemólisis del 50 % a una concentración de 4,5 y 5 g/l.


-Se produce una disminución de la ROE en la esferocitosis hereditaria, en la eliptocitosis u ovalocitosis congénita y en la estomatocitosis hereditaria.


Valoración de los resultados:

-La fragilidad osmótica de los hematíes contenidos en la sangre estudiada es:

Alta.


-La ROE de la sangre analizada es: 

Baja.


Bibliografía:

-Libro de Hematología.

-www.tedpella.com

-www.ce-lab.com

-www.lbre.es