Práctica: Fórmula Leucocitaria.

Fecha: 1/12/2014.

Información sobre la práctica:

La fórmula leucocitaria o también llamada recuento diferencial leucocitario (RDL) consiste en la determinación del porcentaje de cada uno de los distintos tipos de leucocitos con respecto al total de ellos.

Materiales utilizados:

-Papel de filtro.
-Portas.
-Lanceta.
-Gasas.
-Gradilla.
-Capilar heparinizado.
-Microscopio óptico.
-Papel y lápiz o registrador automático de células.

El registrador automático de células es un aparato con unas teclas.Cada tecla representa un tipo de leucocito y cada vez que observas uno de cada tipo presionas un botón distinto.Cuando el número de anotaciones llega a 100, suena una alarma.

Reactivos:

-Aceite de inmersión.
-Alcohol para desinfectar la zona de donde vamos a sacar sangre.
-Cubetas de Wertheim o similares.  


Muestra:

En esta práctica decidimos utilizar sangre capilar fresca, para ello tuvimos que desinfectar la zona con alcohol y con la lanceta pinchar el tercer o cuarto dedo de una mano.Después tuvimos que desechar la primera gota de sangre y el resto la recogimos con el capilar heparinizado.

Objetivos:

-Decir con qué objetivo del microscopio se observan los leucocitos cuando se determina una fórmula leucocitaria.


-Explicar cómo es el recorrido que se describe en la observación leucocitaria.


-Decir cuándo se han de observar al menos 200 leucocitos.


-Si de 100 leucocitos observados, 20 son linfocitos y el WBC es igual a 7.000 leucocitos/ mm cúbico de sangre, ¿cuál es el número de linfocitos que hay en 1 mm cúbico de sangre?


-Decir cómo se llama el aumento de los monocitos.


Procedimiento:

1.Primero hay que realizar una extensión sanguínea con la sangre fresca.


2.Dejamos la extensión secar y procedemos a utilizar una tinción para poder observar mejor los leucocitos. Se puede realizar : Giemsa, Wright o Panóptico rápido, escogimos la última porque es la más rápida de realizar, apenas 15 segundos.


3.La tinción del Panóptico rápido se realizó en una práctica anterior por lo que el procedimiento no lo explicaremos en esta práctica.


4.Para observar la muestra al microscopio óptico tenemos que poner el condensador alto y el diafragma abierto.


5.Enfocar con el objetivo de 10 x.


6.Después añadimos aceite de inmersión para observar con el objetivo de 100 x.


7.Finalmente hay que ir contando la cantidad de leucocitos de cada tipo e id anotando.

El contaje se puede realizar con lápiz y papel  dibujando unas columnas que representen cada una un tipo de leucocito, y se traza una raya en la columna correspondiente cada vez que se ve un leucocito.La otra forma es con el registrador automático de células.

Lectura de resultados:

Cuanto mayor es el número de leucocitos contados  más exacta es la determinación.En práctica se cuentan 100 leucocitos o, como máximo 200.

Si se encuentra un mayor número de linfocitos que de  neutrófilos ( en el adulto) o más de un 10% de eosinófilos o más de un 12% de monocitos, la fórmula leucocitaria se hace contando 200 leucocitos y dividiendo posteriormente el resultado que hemos obtenido entre 2.

Cálculos:

Conociendo el recuento de leucocitos (número de leucocitos por mm cúbico de sangre ) , se puede calcular el número de cada uno de los tipos de leucocitos que está presente en 1mm cúbico de sangre.Se realiza a partir de la siguiente fórmula:

nº TL =  (WBC x % TL) / 100 

nº TL = número de un tipo de leucocito por mm cúbico de sangre.

WBC = recuento de leucocitos (número de leucocitos por mm cúbico de sangre).

%TL = porcentaje que representa ese tipo de leucocito con respecto al resto.


Interpretación clínica de los resultados obtenidos:

Fotografía: Libro de Hematología.

Resolución de los objetivos propuestos:

-Se observan los leucocitos para determinar una fórmula leucocitaria con el objetivo de 10 x.

-Para el contaje de cada tipo de leucocitos de forma manual se deben hacer reparticiones o zonas tomando por cada zona un tipo de leucocito de referencia, aunque también se puede hacer el contaje siguiendo el método del zig-zag.

-Se han de observar al menos 200 leucocitos cuando se encuentre un mayor número de linfocitos que de neutrófilos ( en el adulto ) o más de un 10% de eosinófilos o más de un 12% de monocitos.

-Si de  100 leucocitos que hemos observado , 20 son linfocitos y el WBC es igual a 7.000 leucocitos/ mm cúbico de sangre, ¿cuál es el número de linfocitos que hay en 1 mm cúbico de sangre?

nº TL = (WBC x % TL) / 100 =  ( 7.000 x 20 ) / 100 = 1.400 linfocitos / mm cúbico de sangre.

-El aumento de los mocitos se llama Monocitosis.

Valoración de los resultados:

En la sangre estudiada:

La proporción de leucocitos es normal, porque el número de cada tipo de leucocito se encontraba entre los valores normales.

Práctica: Detección de cuerpos de Heinz.

Fecha: 27/11/2014

Información sobre la práctica:

Los cuerpos de Heinz son precipitados de hemoglobina (Hb) que consisten en una serie de pequeñas granulaciones que se sitúan en la periferia de los eritrocitos y que se tiñen con solución de cristal violeta. 

Cuerpos de Heinz (hematologiaenaccion.blogspot.com)

Materiales utilizados:

-Frasco lavador. -Embudo de filtración.
-Tubo de ensayo.
-Filtro de papel de filtro.
-2 pipetas graduadas.
-Pipeta Pasteur.
-Baño de agua.
-2 portas.
-Microscopio óptico.
-Vaso de precipitado.

Reactivos:

-Alcohol o  lejía para limpiar los portas.
-Colorante: cristal violeta (tenemos que prepararlo).
-Líquido de inmersión para observar al microscopio óptico con el objetivo de 100 x.
-Agua destilada.

Muestra:

Nosotros vimos más conveniente realizar la práctica con sangre fresca.

Objetivos de la práctica:

-Decir cuál es el colorante usado para teñir los cuerpos de Heinz.

-Decir también el color de los cuerpos de Heinz cuando se tiñen.

-Saber dónde se localizan los cuerpos de Heinz.

Procedimiento:

1.Tenemos que realizar el colorante. Se hace de la siguiente forma:
-Primero hay que mezclar 20 g de cristal violeta con 80 cc(80 cm cúbicos = 80 ml) de suero fisiológico y 20 cc de agua destilada.
(A nosotros el colorante ya nos venía preparado, pero estaba al 2% y tuvimos que diluirlo al 10%).

-A continuación hay que agitar la mezcla durante 5 minutos.

-Filtrar la disolución con el embudo y el filtro.

-Añadir al líquido filtrado 82 cc de suero fisiológico y 18 cc de agua destilada.

-Al líquido filtrado hay que añadirle la sangre.

-Por último conservar la solución colorante a temperatura ambiente durante un tiempo indefinido.

2.Mezclar en un tubo de ensayo volúmenes iguales de la solución de cristal violeta y de la sangre que vayamos a utilizar. Nosotros lo hicimos con 1 ml de colorante y 1 ml de sangre.

3.Hay que incubar la mezcla a 37 ºC durante 5 minutos en un baño de agua.

4.A continuación hay que realizar una extensión de la mezcla.

Dimos por válida la tercera extensión y la dejamos secar.

5.Observar al microscopio óptico con ayuda del aceite de inmersión con el objetivo de 100 x.



Resolución de los objetivos propuestos:

-El colorante utilizado para teñir los cuerpos de Heinz es el cristal violeta.

-Los cuerpos de Heinz teñidos se observan de un color púrpura intenso.

-Los cuerpos de Heinz los encontramos en la periferia de los eritrocitos.

Resultados obtenidos:

En la sangre ensayada:

-No se han encontrado cuerpos de Heinz.

Valoración de los resultados:

El sujeto estudiado:

-No tiene una Hb inestable.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos:

La presencia de cuerpos de Heinz, significa la presencia de precipitados de Hb.Se produce en una serie de defectos congénitos de la Hb , conllevan una alteración en el enlace hemo-globina.


Esta alteración en el enlace da inestabilidad a la hemoglobina, hace que ésta se desnaturalice en presencia de determinados medicamentos (ej: sulfamidas) y que precipite intracelularmente el tetrámero ( 4 cadenas polipeptídicas ) de globina.


También pueden aparecer cuerpos de Heinz en el déficit congénito de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, por precipitación de la Hb oxidada.La oxidación de la Hb puede producirse a causa de diversos productos ( ej: antipalúdicos, analgésicos, habas, etc).

Práctica: Contaje de reticulocitos.

Fecha: 27/11/2014.

Introducción:

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros, es la fase anterior a ser un eritrocito. El reticulocito contiene en su interior restos de ARN (ribosomas), mitocondrias y otros órganos celulares.

Tienen un tamaño de 8-9 micrómetros de diámetro.Permanecen en la médula ósea (MO) unos 2 o 4 días y después salen a la sangre periférica, donde maduran un día.

La tinción de los reticulocitos es una tinción supravital porque se hace mientras las células están aún vivas.

Reticulocitos ( Imagen de Hematología artículos)

Materiales utilizados:

-Gradilla.
-Lanceta.
-Gasas.
-Matraz aforado de 100 ml. -Probeta.
-Tubos de hemólisis.
-Pipetas Pasteur.
-Baño de agua.
-Vidrio de reloj.
-Portas.
-Filtro hecho con papel de filtro.
-Microscopio óptico.
-Frasco lavador.
-Capilar con EDTA.
-Balanza.
-Embudo.
-Parafilm.

Reactivos empleados:

-Alcohol o lejía para limpiar los portas.
-Azul de cresil brillante en polvo.
-Solución salina al 0,9%.
-Citrato sódico al 3%.
-Agua destilada.
-Aceite de inmersión.

Muestra:

Para esta práctica lo más aconsejable es utilizar sangre fresca anticoagulada con EDTA , para ello pinchamos con una lanceta la cara lateral del tercer o cuarto dedo de una mano (previamente desinfectado con alcohol y dejado secar para que se evapore), desechamos la primera gota de sangre y recogemos con el capilar con EDTA la sangre de la zona.

Objetivos:

-Conocer qué son los reticulocitos.


-Saber el tipo de tinción que estamos utilizando en la práctica.


-Saber por qué se realiza la corrección del porcentaje de reticulocitos.


-Conocer lo que expresa el IPR.


Desarrollo de la práctica:


1.Primero se debe preparar el colorante:


Mezclamos 80 ml de solución salina y 20 ml de citrato sódico al 3% ( lo hemos hecho al 3%: en un matraz aforado de 100 ml hemos puesto 3g de citrato sódico que se presenta en polvo y hemos enrasado con agua destilada proveniente del frasco lavador hasta la línea de enrase ).


Después pesamos 1g de azul de cresil brillante y lo disolvemos en la mezcla anterior.


Luego, filtramos con un embudo y un filtro.


2.A continuación en un tubo de hemólisis echamos 3 gotas de la solución colorante y otras 3 gotas de sangre total previamente homogeneizada.Mezclamos suavemente y tapamos con parafilm.

3.Lo  introducimos en el baño de agua a 37 ºC durante 5 minutos.

4.Después se vuelve a homogeneizar y se realiza una extensión con la disolución.


Las extensiones salieron muy cortas y no se extendían bien por el porta, por lo que decidimos disolver un poco más la solución 
colorante.


Tras realizar varias extensiones, la que dimos por válida para observar al microscopio fue la número 3 porque en la número 1 la gota fue muy gruesa y la número 2 se nos quedó muy corta.


5.Observar al microscopio con el objetivo de 100 x con ayuda del aceite de inmersión.

Reticulocitos al microcopio óptico (labmedvet.blogspot.com).

Cálculo del porcentaje de reticulocitos:

Al observar al microscopio se deben contar 2.000 hematíes en total, para calcular el porcentaje de reticulocitos tenemos que emplear la siguiente fórmula:

% reticulocitos = ( Nº de reticulocitos contados / Nº de hematíes contados ) x 100

Para descartar errores se deben realizar dos extensiones y hacer el recuento a ambas, por lo que la diferencia entre ellas tiene que ser igual o menor a 5 reticulocitos.

% reticulocitos = ( 16 / 2.000 ) x 100 = 0,8 % de reticulocitos.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos:

En adultos y niños los valores normales están entre 0,5 y 1,5% , nosotros hemos obtenido 0,8%, por lo que se encuentra entre los valores normales de reticulocitos.

La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por ciento es un valor relativo que se refiere a una cifra normal de eritrocitos (en nuestro caso 2.000 ).Por ello, cuando existe una anemia con disminución en al cantidad de eritrocitos se compensa con un aumento de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real.

La corrección se hace en base al hematocrito (HTO) del paciente, se calcula con la siguiente fórmula:

% de reticulocitos corregido = % reticulocitos x ( HTO del paciente / HTO normal )

Si la anemia es muy intensa, aparece en sangre periférica un número mayor de reticulocitos del que correspondería por regeneración eritoblástica. Esto se debe a que el estímulo eritropoyético que compensa va acompañado de un periodo de maduración intramedular más corto y una etapa de maduración en sangre periférica más larga.

Esto se conoce como "desviación reticulocitaria".Se debe hacer una segunda corrección del % de reticulocitos en función de los días que tarda en madurar el reticulocito en sangre periférica, y a esto se le llama índice de producción reticulocitaria (IPR).

Se utiliza la siguiente fórmula:

IRP = % reticulocitos corregido / días de maduración en sangre periférica

Esta tabla muestra los días que tarda en madurar el reticulocito:

(Libro de Hematología)

Un IPR mayor de 3 nos indica un aumento de al actividad eritropoyética medular, mientras que un IPR menor de 2 indica una escasa actividad eritropoyética.

Resolución de los objetivos propuestos:


-Los reticulocitos son la fase anterior al eritrocito.Se origina por maduración del eritroblasto ortocromático.


Los reticulocitos no presentan núcleo, son algo mayores que los eritrocitos (8-9 micras )., su citoplasma todavía posee alguna cantidad de ARN y conserva cierta tonalidad azulada.Contiene algo de sustancia ribosómica y reticular que es visible mediante la tinción vital de azul cresil brillante.


Permanecen de 2 a 4 días en la médula ósea y 1 día en la sangre periférica hasta terminar de madurar y transformarse en eritrocito.


En condiciones normales, los eritrocitos constituyen del 0,5 al 1,5% del total de los eritrocitos circulantes.


-Estamos utilizando una tinción supravital de azul de cresil brillante.


-Hacemos la corrección del porcentaje de reticulocitos porque existe una anemia con disminución en la cantidad de eritrocitos que se compensa con un aumento en el número de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real.


-El índice de producción reticulocitario (IPR) nos proporciona un valor numérico de la estimulación hematopoyética por encima de la actividad de la línea base normal.


Errores cometidos:


El error más significativo fue al realizar la solución colorante, debido a que, al no estar bien disuelto el frotis ,no se podía realizar correctamente la extensión.


Otro posible error pudo ser al contar el número de reticulocitos .Nosotros fuimos contando los reticulocitos de la muestra en forma de zig-zag y separando la muestra en secciones con reticulocitos guía, pero no es un contaje 100% fiable.


Propuestas de mejora:

Para el contaje de reticulocitos hubiese sido más preciso utilizar un autoanalizador.

Práctica: Determinación del valor hematocrito mediante el micrométodo.

Fecha: 21/11/2014.

Información sobre la práctica:


Cuando centrifugamos la sangre podemos diferenciar dos fracciones:


-Fracción forme: contiene hematíes (aprox. 45 %).
Se deposita en el fondo el tubo.
Un  pequeño porcentaje (aprox. 1%) son plaquetas y leucocitos.
Se sitúan entre el plasma y los hematíes formando una pequeña capa llamada buffy coat.


-Fracción líquida: es el plasma sanguíneo ( aprox. 55%).
Es el líquido sobrenadante.

El hematocrito ( HTO, HTC O HCT ) es la relación que existe entre el volumen ocupado por los hematíes y el ocupado por la sangre total, expresada en forma de porcentaje.


Este valor no es exactamente igual en todas las zonas vasculares del organismo.Así pues, el hematocrito obtenido con sangre capilar es algo superior al logrado a partir de sangre venosa.

Material necesario:

-Capilares heparinizados.

-Lector de microhematocrito.En nuestro laboratorio hay estos dos:

-Lanceta.
-Gasas.
-Plastilina.
-Centrífuga de microhematocrito.

-Regla milimetrada.



Reactivos

-Alcohol para desinfectar la zona de la que vamos a extraer la sangre.



Muestra:


Se puede utilizar sangre venosa o capilar. La venosa debe ser recogida en tubos con EDTA tripotásico.


Preferimos utilizar sangre capilar recogida con el capilar heparinizado (La primera gota de sangre fue desechada).


Debemos recordar que el HTO con sangre capilar sale más alto que con sangre venosa.


Objetivos de la práctica:


-Determinar el valor del hematocrito (HCT) mediante métodos manuales y métodos automáticos.


El HCT obtenido por métodos automáticos es más exacto porque en los  métodos manuales también se cuentan, junto con el volumen de hematíes, el de leucocitos, plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hematíes.


Utilizaremos dos instrumentos:


*Regla milimétrica.


*Lector de microhematocrito.


-Saber el significado de la franja roja que tienen algunos capilares de microhematocrito.


-Saber la fuerza relativa de centrifugación (g) se centrifuga la sangre.


-Determinar cuál es el valor del hematocrito si lamedida de la columna de eritrocitos es es de 20 mm y la de la columna total es de 50 mm.


-Decir cómo debe ser la forma de actuar si con un capilar se obtiene un HTC de 45 y con el otro uno de 43.



Procedimiento de la práctica:


1.Tras haber desinfectado con alcohol, pinchado con una lanceta el tercer o cuarto dedo de una mano y desechar la primera gota de sangre, podemos llenar hasta las 3/4 partes de longitud de un capilar heparinizado.

2.Limpiar el exterior del capilar con una gasa.


3.Sellar el extremo del capilar por la parte por la que ha entrado la sangre con plastilina.Se realiza, penetrando el capilar en una bolita de plastilina y haciéndolo traspasar.


4.Colocar el capilar en la centrífuga de microhematocrito con la punta de la banda roja hacia dentro y la punta sellada con la plastilina, pegada a la pared de la centrífuga.


No hay que olvidar que hay que colocar de manera equilibrada los capilares, para ello, llenamos otro capilar con la misma cantidad de sangre que el anterior y los ponemos enfrentados.


5.Centrifugar los capilares a 12.000 g durante 5 minutos.


Calculo de los resultados:


Se puede hacer de dos maneras:


-Con un lector de microhematocrito:

UTILIZACIÓN DE UN LECTOR DE MICROHEMATOCRITO:


1.Situamos el capilar lleno 3 / 4 partes de su longitud en la ranura, con la columna de eritrocitos hacia el punto rojo.


2.Girar el disco central para hacer coincidir:


-La línea más alejada del punto rojo, con el final de la columna de plasma.
-La línea más cercana al punto rojo, con el inicio de la columna de eritrocitos.
-La línea central, con la interfase de separación presente entre el plasma y los eritrocitos.


3.Finalmente leemos en la escala inferior el valor del hematocrito.


A nosotros nos salió que el hematocrito es el 44% del total de la sangre.


-Con una regla milimetrada:

1.Hay que medir la distancia que existe desde que termina el tapón de plastilina hasta donde termina el plasma, a esa distancia la llamaremos "T".


2.Después hay que medir la distancia existente desde que termina el tapón de plastilina hasta donde termina la columna de eritrocitos, a esa distancia la vamos a llamar "E".


3.Finalmente calculamos el hematocrito mediante una regla de tres.


CÁLCULOS:


T= 5,5 cm = 55 mm.
E= 2,5 cm = 25 mm.


Si T_____100%     HTO= (E x 100) / T = (25 x 100) / 55 = 45,5%
E_______HTO



Haciéndolo con el lector de microhematocrito nos salió un HTO = 44% Y haciéndolo con la regla milimétrico nos salió un HTO =45,5%.


Estas dos pruebas se realizaron por duplicado (ambas) y los resultados salieron muy similares, como no tuvieron una diferencia superior al 2% no hizo falta volver a repetirlos.


Si la diferencia entre ambos capilares nos hubiese salido superior al 2%, habría que repetir la determinación .

En el caso de que la diferencia hubiese sido menor del 2% , hacemos la media de los dos valores, si el valor final del HTO es mayor del 50% se repite la determinación  alargando la centrifugación 5 minutos más (hasta10 minutos en total).



Interpretación clínica de los resultados obtenidos:


El valor normal del HTO está comprendido entre el 42 y el 47% en las mujeres, y entre el 45 y el 52% en los hombres.


Un valor bajo del HTO suele ser signo de una anemia y un valor alto del HTO suele ser signo del padecimiento de una poliglobulina.



Resolución de los objetivos propuestos:


-La franja roja que tienen los capilares de mocrohematocrito significa que llevan un anticoagulante llamado heparina.


-La sangre se centrifuga a 3.000 r.p.m.

-Si la medida de la columna de eritrocitos es de 20 mm y la de la columna total es de 50 mm , ¿ cuál es el valor del HTO ?


T= 50 mm.
E= 20 mm.

Si T _____100%        HTO = (E x 100) / T = (20 x 100) / 50 = 40%
E________HTO


- Si con un capilar se obtiene un HTO de 45% y con otro capilar se obiene un HTO de 43% , ¿cómo debe ser la forma de actuar ante estos resultados?


Hay una diferencia del 2% , por lo tanto, el resultado se da por válido.


Resultados obtenidos:


Como he mencionado anteriormente, hemos hecho ambas pruebas
 ( lector de microhematocrito y regla milimetrada ) por duplicado y como nos ha salido una diferencia del 2% se dan los resultados por válidos.


En el caso del lector, nos ha dado un valor del HTO del 44 % y con la regla milimetrada del 45,5 %.

Es más fiable el resultado que nos proporciona la regla milimetrada.


Valoración de los resultados:


El valor final de la determinación indica que el HTO es:


Normal.


Bibliografía:


-Libro de Hematología.

-www.brandsd.com

-www.cientificaschonfel.com

Práctica: Recuento de hematíes.

Fecha: 21/11/2014.

Introducción sobre la práctica:


El recuento de hematíes se realiza para determinar el número de eritrocitos presentes en un volumen determinado de sangre 
( normalemente, en 1 mm cúbico de sangre ).


Materiales necesarios:


-Papel de filtro.

-Gradilla.

-Embudo de fitrado (en el caso de que el líquido de dilución de Hayem contenga precipitados ).

-Frasco lavador.

-Vaso de precipitado.

-Prepipeta.

-Microscopio óptico.

-Cubre.

-Tubos de ensayo.

-Pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos rojos (Perla de dentro del bulbo roja) o micropipeta.

-Puntas de micropipeta.

La que la tiene blanca es para el recuento de glóbulos blancos.

-Tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.
El que tiene la punta de color rojo es para recuento de glóbulos rojos y el de la punta blanca para el recuento de glóbulos blancos.

-Cámara de recuento de Neubauer mejorado.

Superior, campo claro e inferior, campo oscuro.

Reactivos:


Se debe emplear un líquido de dilución que sea isotónico para evitar la alteración morfológica de los eritrocitos e incluso su lisis.


El que más se utiliza es el de Hayem, se compone de:


-2,5 g de Na2SO4 (Sulfato sódico).
-0,5 g de NaCl (Cloruro sódico).
-0,25 g de HgCl2 (Cloruro mercúrico).
-100 ml de agua destilada.


En el caso de que el líquido de dilución de Hayem contenga precipitados, debemos filtrar con el embudo.


Muestra:


Sangre capilar fresca o sangre venosa anticoagulada con EDTA.



Utilización de micropipeta en lugar de pipeta de Thoma:

Siempre debemos hacer una dilución: 1/100 si enrasamos hasta la señal de 1 o 1/200 si enrasamos hasta la señal de 0,5. (Normalmente dilución 1/100).

Si utilizamos 1ml de dilución = 1.000 microlitros:

1/100 = 0,01 ml = 10 microlitros de sangre.

1.000 microlitros totales - 10 microlitros de sangre = 990 microlitros de líquido de Hayem.

Una vez realizados los cálculos procedemos a la práctica:

Con una micropipeta depositamos 10 microlitros de la muestra de sangre en una tubo de ensayo y 990 microlitros de líquido de Hayem con otra punta de micropipeta. Por último agitamos la dilución. 

Objetivos de esta práctica:


-Contar el número de eritrocitos que hay en un determinado volumen de sangre, necesitamos la ayuda de la cámara de recuento de Neubauer, un cubre y un microscopio óptico.


-Saber qué hacer si el líquido de Hayem contiene precipitados.


-Determinar cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre cada uno de los cuadrados pequeños donde se han contado los eritrocitos.


-Decir cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre cada uno de los cuadrados medianos donde se han contado los eritrocitos.


-Determinar el volumen de sangre diluida que hay sobre el cuadrado central.


-Si la pipeta de Thoma se enrasa con sangre hasta la señal de 1, ¿cuál es la dilución posteriormente obtenida?.


-Si la sangre se diluye a 1/200 y se cuentan 450 eritrocitos en 5 cuadrados medianos, ¿cuál es el RBC obtenido?.


Desarrollo de la práctica:


1. Primero hay que situar el cubre sobre el retículo de la cámara de Neubauer ejerciendo una pequeña presión a la vez que se desliza el cubre sobre las bandas laterales habiendolas humedecido con agua destilada.

2. Aspirar con la pipeta de Thoma unida al tubo de goma con boquilla (El tubo está unido a una prepipeta) hasta la señal de 1 (para saber si hay anemia).

En el caso de que nos hayamos pasado al enrasar hay que hacer descender la columna de sangre tocando la punta de la pipeta de Thoma con un algodón o gasa.

3. Limpiar bien el exterior de la pipeta con cuidado y aspirar el líquido de Hayem (que hemos depositado previamente en un vaso de precipitado) hasta la señal de 101.


4. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta de Thoma y homogeneizar el contenido del bulbo. Hay que sujetar la pipeta de Thoma por sus extremos , con los dedos pulgar e índice, agitando suavemente en sentido horizontal durante aproximadamente 2-3 minutos.

5. Después hay que desechar las tres primeras gotas emitidas por la pipeta.


6. Depositar la siguiente gota entre la cámara de recuento de Neubauer y el cubre.Se realiza poniéndola en uno de los bordes no adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas estructuras.Hay que evitar la formación de burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre.

7. Dejamos reposar durante unos minutos para que las células presentes en ella puedan sedimentarse.


8. Ya podemos observar al microcopio óptico con el objetivo de 40 x y con el condensador a baja altura.


Interpretación de los resultados:


Hay que contar los 5 cuadrados medianos ( 4 de las esquinas y 1 central) y para evitar contar repetidamente los mismos eritrocitos, solo se cuentan los que están contenidos dentro del cuadrado y los que están en contacto con sus líneas de demarcación superior o derecha.

El libro aconseja que se siga el orden de "zig-zag" a la hora de contar los eritrocitos.


Hemos contado un total de 481 eritrocitos en los 5 cuadrados.


Para calcular el número de eritrocitos vamos a emplear la siguiente fórmula:


RCB = H x 5 x 10 x D.


-RCB, es el recuento de hematíes ( número de hematíes por mm cúbico de sangre ),la "H" es el número de 
hematíes contados en los 5 cuadrados medianos.


 -Se multiplica por 5 ya que el cuadrado grande central tiene 25 cuadrados medianos ( se hace esto para calcular el nº de hematíes en el cuadro central grande ).


- Después se multiplica por 10 porque la longitud del cuadrado grande central es de 1mm y la longitud del espacio entre éste y el cubre es de 0,1 mm y queremos el nº de hematíes en 1mm cúbico, no en 0,1 mm cúbicos.


-A continuación hay que multiplicar por 100 debido a que hemos partido de que en la pipeta de Thoma hemos enrasado con sangre hasta 1 (para saber si hay anemia), si queremos saber si hay policitemia se multiplica por 200 y se enrasa hasta la línea de 0,5. Hemos hecho una dilución: 1/100


-Finalmente, se multiplica por "D" , que es el factor de dilución.


Antes de proceder a hacer los cálculos, hay que recordar que el margen de error de esta técnica es alto ( es de +20 o -20 % ).


Cálculos:


RCB = 481 x 5 x 10 x 100 = 2.405.000 / mm cúbico de sangre.


Interpretación de la cantidad obtenida:


Se considera normal un recuento de hematíes (RBC) comprendido entre los 4 y los 5,5 millones / mm cúbico en las mujeres, y entre los 4,5 y los 6 millones / mm cúbico en los hombres.


Hemos obtenido un RBC de 2.405.000 / mm cúbico de sangre, está muy por debajo de la media, por lo que posiblemente la sangre que hemos utilizado ( sangre venosa anticoagulada ) no se encuentre en las mejores condiciones.


RESOLUCIÓN DE LOS OBJETIVOS PROPUESTOS:


- Si el líquido de Hayem contiene precipitados hay que filtrarlo.


- V= l x l x h = 0,0625 mm x 0,0625 mm x 0,1 mm = 0,000390625 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado pequeño periférico y V= l x l x h = 0,05 mm x 0,05 mm x 0,1 mm = 0,00025 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado pequeño central.


-V= l x l x h = 0,25 mm x 0,25 mm x 0,1 mm = 0,00625 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado mediano periférico y V= l x l x h = 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm = 0,004 mm cúbicos de sangre diluida en cada cuadrado mediano central.


- V= 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm cúbicos.


- La dilución posteriormente obtenida si la pipeta de Thoma se enrasa hasta la señal de 1 es de 1 / 100.


-Si la sangre se diluye a 1 / 200 y se cuentan 450 eritrocitos en 5 cuadrados medianos el RBC es:


RBC = 450 x 5 x 10 x 200 = 4.500.000 / mm cúbico de sangre.


En este caso el RBC ha dado un resultado que puede considerarse válido, ya que, el valor está dentro de la media.


VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS:


Sexo de la persona a la que pertenece la sangre:


-Femenino.


El RBC obtenido es:


-Bajo.


Bibliografía:


-www.omelsnlozaa.blogspot.com

-www.marienfeld-superior.blogspot.com

-www.rsulab.mx

-www.ugr.es