Práctica: Electroforesis de hemoglobina.

Fecha: 29/01/2015 y 3/02/2015.


Información sobre la práctica:

La electroforesis es una técnica analítica que sirve para separar las moléculas en función de su carga eléctrica neta.


Cuando se aplica una corriente eléctrica a un medio electrolítico que contiene moléculas cargadas, las moléculas cargadas negativamente (aniones) se desplazan hacia el electrodo positivo (ánodo), y las moléculas  cargadas positivamente (cationes) se desplazan hacia el electrodo negativo (cátodo).


Las proteínas son moléculas anfóteras, es decir, pueden estar cargadas positiva o negativamente o no estarlo, según el pH del medio en el que se encuentran.


Así pues, cuando el pH del medio que circundan las proteínas es neutro, éstas se comportan como partículas no cargadas. Sin embargo, si el pH del medio que las rodea es ácido, las proteínas adquieren una carga eléctrica neta positiva. Y por el contrario, cuando el pH es básico (o alcalino), las proteínas se cargan negativamente.



Fundamento:

En las electroforesis de hemoglobinas, el hemolizado se deposita sobre un soporte empapado de un líquido alcalino, en nuestro caso sobre tiras de cellogel empapadas en tampón de pH 8,8.


Como las cadenas polipeptídicas de la globina en medio básico adquieren una carga eléctrica neta negativa, las hemoglobinas se van desplazando progresivamente hacia el ánodo (migración).


En la sangre hay varios tipos de hemoglobinas y cada una de ellas adquiere la carga eléctrica de una forma más o menos intensa. Así pues, las más electronegativas avanzan más rápido hacia el ánodo y las menos electronegativas lo hacen más lentamente.


Al cabo de un tiempo, las moléculas de hemoglobina idénticas se agrupan entre sí y adoptan el aspecto de bandas.


Cada banda está constituida por un tipo diferente de hemoglobina y se separa del resto debido a su distinta carga eléctrica neta y, por consiguiente, a su diferente capacidad de migración.


1º Parte: Preparación del hemolizado.

Materiales utilizados:

-Papel de filtro.

-Gradilla.

-2 tubos de centrífuga cónicos.

-Tubo de ensayo.

-Vasos de precipitado.

-Rotulador de vidrio.

-Pipetas Pasteur.

-Centrífuga.

-Micropipeta.

-Puntas de micropipeta.

-Mascarilla.

-Frasco lavador.


Reactivos:

-Suero fisiológico o suero salino preparado previamente en clase (solución de Cloruro de Sodio al 0,9%).

-Agua destilada.

-Cloroformo o triclorometano.

Muestra:

Nosotros utilizamos sangre venosa anticoagulada.


Desarrollo de la práctica:

1. En un tubo de centrífuga cónico ponemos 3 ml de la sangre muestra y lo mismo hacemos con el otro tubo (esto se hace porque en la centrífuga deben estar enfrentados).


2. Centrifugamos a 3.500 rpm durante 10 minutos.


3. Una vez centrifugado, quitamos el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur.

4. Añadimos 4 ml de suero fisiológico y homogeneizamos.


5. Lo metemos a la centrífuga a 3.500 rpm durante 10 minutos.


6. Quitamos el sobrenadante con la pipeta Pasteur.


7. Volvemos a añadirle 4 ml de suero salino y homogeneizamos con el agitador de tubos.


8. Lo metemos en la centrífuga a 3.500 rpm durante 10 minutos y le quitamos el sobrenadante.


9. A continuación y ya por última vez, añadimos 4 ml de suero salino y homogeneizamos con el agitador de tubos.


10. Centrifugamos a 3.500 rpm durante 10 minutos y quitamos el sobrenadante (los lavados con suero salino en total son 3).

11. Añadimos 1,5 ml de agua destilada y después 0,5 ml de cloroformo.


12. Después, centrifugamos a 3.500 rpm durante 20 minutos.

13. Por último, retiramos el hemolizado (el sobrenadante) con ayuda de una pipeta Pasteur. 



Lectura de resultados:

Finalmente, hemos podido observar las 3 fases: Cloroformo (inferior) , restos celulares (intermedia) y hemolizado con hemoglobina (superior).



2º Parte: Electroforesis y lectura de resultados.

Materiales utilizados:

-Papel de filtro.

-Pinzas.

-Placa de vidrio.

-Tiras de cellogel (si se gasta el líquido que contiene el bote, rellenar con metanol).

-Estufa.

-Reloj.

-Fuente de alimentación.

-Una cubeta para llevar a cabo la electroforesis.

-Un puente.

-Capilares.

-Rodillo.

-Bandejas de plástico.

-Agitador de bandeja.

-Frasco lavador.


Reactivos:

-Agua destilada.

-Solución decolorante: Solución ác. Acético 5 %.

-Colorante: Negro amido.

-Deshidratación: Metanol.

-Tampón de pH 8,8.

-Solución transparentadora.

Muestra:

El hemolizado (el sobrenadante) preparado anteriormente.


Objetivos de la práctica:


-Decir de qué material son las tiras utilizadas en esta técnica.


-Decir el decolorante del negro amido.


-Saber cómo se llama el aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurabale.


-Saber en qué enfermedad aparece una banda electroforética de hemoglobina S.


-Decir cuál es la hemoglobina  normal más electronegativa.


Procedimiento:

1. Colocar las tiras de cellogel en el tampón para que empapen durante 10 minutos.

2. Después de los 10 minutos hay que secarlas un poco con papel de filtro.


3. Montar el puente colocando la cara absorbente de las tiras hacia arriba (poner la esquina cortada en la derecha y mirando hacia el operador). Los 2 extremos de la tira deben tocar la solución tampón.

4. A continuación, debemos colocar la muestra teniendo en cuenta que el hemolizado tendrá que ir del cátodo (negro) al ánodo (rojo).


5. Dibujamos una pequeña línea de referencia con un lápiz en el extremo de la parte absorbente de la tira.


6. Al lado de la línea dibujada con el lápiz hacemos una fina línea con el hemolizado anterior.

7. Tapamos la cubeta y ponemos en marcha el alimentador a 400 W durante 20 minutos.

8. Una vez que ha terminado la electroforesis, desconectamos y sacamos la tira del puente con las pinzas.


9. Las tiras las colocamos boca abajo en una bandeja de plástico llena de colorante negro amido (reciclado) y colocamos la bandeja en un agitador de bandeja durante 10 minutos.

10. Retiramos el negro amido de la bandeja y sumergimos la tira en otra bandeja con la solución decolorante: ácido acético al 5%. La dejamos 10 minutos agitándose.

11. El paso anterior lo volvemos a repetir 2 veces, si es necesario se repite 3 veces.


12. Quitar el ácido acético y sumergir las tiras en otra bandeja con metanol (deshidratación) durante 1 minuto.

13. Después, en otra bandeja de plástico ponemos solución tansparentadora y depositamos las tiras igual que en los pasos anteriores (boca abajo) durante 2-3 minutos.


14. Colocamos con la ayuda de unas pinzas las tiras y las pasamos a la placa de vidrio con la cara absorbente hacia abajo.

15. Aplastar con el rodillo y meter en la estufa a 60 ºC durante 5-6 minutos aproximadamente (hasta que la tira quede transparente).

Interpretación clínica de los resultados:

La electroforesis de hemoglobina permite detectar anomalías hemoglobínicas cuantitativas o cualitativas. Pueden leerse los resultados visualmente o fotodensitométricamente.


Las anomalías cuantitativas de la hemoglobina se deben al aumento y/o a la disminución de un tipo normal de hemoglobina con respecto al resto. Esto sucede, por ejemplo, en las beta talasemia.


Las anomalías cualitativas de la hemoglobina (hemoglobinosis) se deben a pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos que componen las cadenas de globina de algunas moléculas de hemoglobina. Estos cambios modifican la carga eléctrica de estas moléculas de hemoglobina y determinan una variación en su capacidad de migración. Las hemoglobinosis se detectan, por tanto, en la electroforesis, debido a la aparición de bandas de hemoglobinas anormales. Éste es el caso de la anemia falciforme y el de la hemoglobinosis C.


En nuestro caso, obtuvimos unos valores normales de hemoglobina, no apareció ningún tipo anormal de hemoglobina.


Resolución de los objetivos propuestos:

-Las tiras empleadas en esta técnica son de cellogel.


-El decolorante del negro amido es el ácido acético al 5%.


-El aparato que lee las bandas de las tiras y las transforma en curvas de área mensurable es el fotodensitómetro.


-La banda electroforética de Hb S aparece en la anemia falciforme tanto homocigótica como heterocigótica.


-La hemoglobina normal más electronegativa es la del recién nacido porque presenta un total del 100% de Hb (Hb F y Hb A) y el adulto presenta un total del 99,5 % de Hb ( Hb A2 y Hb A).


Bibliografía:

-www.marienfeld-superior.com

-www.guinama.com

-www.gslhema.blogspot.com

-www.laborayud.com