ÍNDICE

viernes, 22 de mayo de 2015

Práctica: Prueba cruzada mayor.

Fecha: 22/05/2015.


Introducción:


El objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar las posibles reacciones antígeno-anticuerpo entre la sangre del donante y la del receptor, antes de la transfusión.


Para ello, es imprescindible realizar las siguientes determinaciones: 


-Tipaje correcto del grupo ABO y Rh del donante y del recptor: siempre se intentará transfundir sangre del mismo grupo del receptor, y si no es posible, se usará una sangre compatible.



-Escrutinio de los anticuerpos irregulares en el receptor: Si se detectan anticuerpos irregulares, deberán ser identificados para administrar sangre que carezca de los antígenos correspondientes. No es imprescindible realizar esta determinación en la sangre del donante, ya que el volumen de plasma transfundido es pequeño en comparación con el plasma del receptor, pero sí es conveniente hacerla para evitar riesgos.


-Prueba cruzada mayor: Trata de determinar la incompatibilidad entre las sangres enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante. (Es la que vamos a realizar).


Otras pruebas que también pueden realizarse son:


-La prueba cruzada menor: se enfenta el suero del donante con los hematíes del receptor. Solo se hace cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa. La utilización de concentrados de hematíes hace innecesaria la realización de esta prueba.


-Un autocontrol: donde se buscan autoanticuerpos mediante el enfrentamiento entre el suero del receptor y sus propios hematíes.


Todas estas pruebas se hacen en medio salino y en medio albuminoso, para detectar todos los anticuerpos presentes.


























Fundamento de la práctica:


Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, después , en medio albuminoso, y por último frente al suero antiglobulina de Coombs. Con el último paso, detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.


Es importante respetar los tiempos de incubación, así, evitaremos posibles errores.



Materiales:


-Papel de filtro.

-Tubos de hemólisis.

-Centrífuga.

-Baño de agua.

-Pipetas Pasteur de vidrio.

-Gradilla.

-Vaso de precipitado.

-Reloj.

-Papel Parafilm.

-Visualizador.















Reactivos:


-Solución salina fisiológica al 0,9 %.























-Albúmina bovina al 30 %.




















-Suero antiglobulina de Coombs.



















Muestras:


-Suero del receptor, por ejemplo: del grupo B + y hematíes lavados tres veces con solución salina y resuspendidos en ella al 5 % del grupo A2 + (del donante).


Plasma del grupo B + ( receptor).

















Hematíes lavados 3 veces y resuspendidos
al 5 % del grupo  A2+ (donante).


















Objetivos propuestos:


-Decir qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor.


-Sabe cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor.


-Explicar por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoideo.


-Decir qué pone de manifiesto  el suero antiglobulina de Coombs.




Desarrollo de la práctica:


1º. En un tubo de hemólisis añadimos 1 gota de suspensión de hematíes del donante al 5% (grupo A2+) y 2 gotas del suero del receptor (grupo B +).


2º. Mezclamos suavemente y dejamos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. (Hemos realizado 2 para enfrentar en la centrífuga).













3º. Centrifugamos a 2.500 r.p.m durante 1 minuto.


4º. Leemos el resultado obtenido en medio salino.
















Lectura de resultados:


Se realiza resuspendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones.




Interpretación clínica de los resultados:


La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangre son compatibles, y por tanto, la transfusión es posible.


La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.



Resultados obtenidos:


A nosotros nos aglutinó en la primera fase: en medio salino.


En el caso de que no nos hubiese aglutinado a la primera hay que hace lo siguiente:


1º. Añadir al tubo, 3 gotas de albúmina bovina al 30 %.


2º. Mezclar e incubar en el baño de agua durante 30 minutos a 37 ºC.


2º. Centrifugamos a 2.500 r.p.m durante 1 minuto.


3º. Leemos el resultado obtenido en medio albuminoso.


Si nos sigue sin salir el botón hemático, continuamos con el último paso.


4º. Lavamos 3 veces los hematíes con solución salina al 0,9 % oara eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retiramos el sobrenadante del último lavado.


5º. Añadimos una gota de suero antiglobulina humana de Coombs al tubo. Mezclamos y centrifugamos a 1.000 r.p.m durante 2 minutos.


6º. Leemos los resultados obtenidos con el suero de Coombs.


Si sigue sin haber presencia de botón hemático,  la sangre se puede transfundir.



Valoración de los resultados:


Las sangres analizadas son:

-Incompatibles.



Resolución de los objetivos propuestos:


- En la prueba cruzada mayor se enfrenta suero del receptor con hematíes del donante.


-La prueba cruzada menor se debe realizar solo cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso,la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa.


-La prueba se debe realizar en medio salino y albuminoideo porque queremos saber si se produce aglutinación en alguno de los tres medios para descartar la transfusión si se produce aglutinación en alguno de ellos.


-El suero antiglobulina de Coombs pone de manifiesto anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.




Bibliografía:


-es.slideshare.net

Práctica: Determinación rápida de Hemoglobina.

Fecha: 21/05/2015.



Introducción:


En las normas para la selección de donantes de sangre se establece que la concentración de Hb debe ser determinada cada vez que haya una donación.


Los valores mínimos antes de donar tienen que ser los siguientes:


-En mujeres: 12,5 g/dl.

-En hombres: 13,5 g/dl.



Fundamento de la práctica:


Para determinar la concentración de hemoglobina justo antes de una donación, es necesario un método rápido aunque no sea preciso.


Este método se basa en el hecho de que una sangre con una concentración de Hb superior a la permitida, para poder efectuar una donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre (CuSO4). Por lo que, en estas circunstancias, una gota de sangre problema se deja caer libremente a través de la solución de sulfato de cobre (CuSO4).























Materiales utilizados:


-Vaso de precipitado de 50 ml.

-Probeta graduada de 100 ml.  

-Papel de filtro.

-Matraz aforado de 100 ml.

-Papel Parafilm.

-Micropipeta.

-Puntas de micropipeta.

-Varilla de vidrio.

-Embudo.

-Lancetas.

-Gasas.

-Capilares heparinizados.

-Frasco lavador.



Reactivos:


-Agua destilada.

-Sulfato de cobre en polvo.

-Alcohol para desinfectar.



Muestra:


-Sangre capilar fresca o sangre de bolsa anticoagulada.



Objetivos propuestos:


-Decir cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación.




Procedimiento de la práctica:



1º.Primero hacemos una disolución de densidad 1,052 g/dl. Para ello, disolvemos 17g de sulfato de cobre en 100 ml de agua  destilada.Esta va a ser la solución madre.


























2º. La densidad de la disolución de sulfato de cobre varía con la temperatura. Por ello, para obtener la misma densidad a una temperatura ambiente de 22º C , se añaden 0,74 ml = 740 microlitros de agua destilada con ayuda de una micropipeta.



3º. Mezclamos 51 ml de solución madre con 49 ml de agua destilada en una probeta graduada de 100 ml.  



















4º. Agitamos con una varilla de vidrio hasta homogeneizar. 



5º. Ponemos la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 ml con ayuda de una varilla de vidrio para no salpicar.


6º. Desinfectamos el tercer o cuarto dedo de una mano con alcohol y pinchamos con la lanceta.


7º. Depositamos la gota de sangre sobre la solución de sulfato de cobre.






















Lectura de resultados:


Si la gota de sangre es más densa que la solución de sulfato de cobre cae libremente a través de ella.


Por el contrario, si la gota es menos densa que la solución de sulfato de cobre no cae al fondo del vaso de precipitados que contiene esta solución.



Interpretación de los resultados:


Una gota de sangre con más de 12 g/dl de Hb tiene una densidad mayor que 1,052 g/cm3.



Si la gota de sangre cae libremente a través de la solución, tiene una densidad mayor que 1,052 g/ cm3 y, por lo tanto, tiene una conentración de Hb superior a 12 g/dl.


Si la sangre tiene una concentración de Hb superior a 12 g/dl, la persona puede donar sangre.


En caso contrario, no se puede hacer la donación.




Resultados obtenidos:


Probamos con varias personas y todas las gotas cayeron hacia el fondo. Por tanto, todos podían donar.



Resolución de los objetivos propuestos:


-El valor mínimo de Hb que debe tener una mujer antes de la donación es de 12,5 g/dl.










Práctica: Determinación de un Du (Antígeno D débil).

Fecha: 20/05/2015. 


Información sobre la práctica:



En algunos casos, los anticuerpos tipo Ig G  son incapaces de producir aglutinación de los hematíes por sí solos. Sin embargo, son capaces de adherirse a sus superficie y decirnos qu ehan sensibilizado a los hematíes. También son capaces de fijar el complemento, sin llegar a producir hemólisis de los hematíes.


Estos anticuerpos tipo Ig G pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen anticuerpos antiglobulina humana del tipo Ig M. El resultado de esta reacción es una aglutinación de los hematíes.


El suero antiglobulina humana es lo que llamamos suero de Coombs.


La prueba de Coombs puede realizarse de dos formas:

-Pruba directa: Buscamos anticuerpos del paciente enfrentando suero comercial (el de Coombs) con hematíes del paciente.


-Prueba indirecta: en este caso, enfrentamos los hematíes del paciente con suero Anti-D , después con Coombs y lavamos.








Fundamento:


El Du es un antígeno D débil que no se pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación del Rh.

Por ello, debemos sensibilizar antes los hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti-D, y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno Du en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana, y en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero antiglobulina humana.

En esta práctica vamos a realizar una prueba de Coombs indirecta.



Material necesario:


-Tubos de hemólisis.

-Centrífuga.

-Gradilla.

-Papel de filtro.

-Baño de agua.

-Reloj.

-Pipetas Pasteur de vidrio.

-Vaso de precipitado.

-Contenedor biológico.

-Visualizador.








Reactivos:


-Suero anti-D humano.




-Suero antiglobulina human de conejo (suero de Coombs).





-Suero salino fisiológico al 0,9 %.






Muestra:


-Hematíes de la sangre problema previamente lavados 3 veces en suero fisiológico y suspendidos al 5 % en dicha solución.

(El lavado de hematíes y la suspensión al 5 % lo hemos realizado en prácticas anteriores).







Objetivos propuestos:


-Decir el contenido del suero de Coombs.


-Saber qué se detecta con la prueba directa.


-Saber qué podemos detectar con la prueba indirecta.


-Decir qué buscamos en la sangre del paciente.


-Explicar qué ocurre si el control es positivo.



Desarrollo de la práctica:


1º. En un tubo de hemólisis colocamos una gota de suero anti-D y otra gota de suspensión de hematíes al 5 % con ayuda de 2 pipetas Pasteur de vidrio.



2º. Mezclamos con cuidado e incubamos en el baño de agua a 37 ºC durante 30-45 minutos.



3º. Después, lavamos los hematíes en solución salina tres veces consecutivas a 1.000 r.p.m durante 1 minuto (es a menos revolucines y menos tiempo porque ya están lavados de antes).



4º. Quitamos el sobrenadante con otra pipeta Pasteur de vidrio.



5º. Sobre el sedimento del tubo de hemólisis añadimos una gota de suero de Coombs con otra pipeta Pasteur de vidrio y mezclamos suavemente.


6º. Por último, centrifugamos el tubo a 1.000 r.p.m durante 1 minuto.


En las prácticas con centrífuga es muy importante recordar que siempre hay que enfrentar los tubos.


Lectura de resultados:


Golpeamos suavemente el fondo del tubo para ver la presencia o ausencia de aglutinación.



Interpretación clínica de los resultados:


Si hay aglutinación , el resultado es positivo. Indica que en la membrana de los hematíes hay antígeno Du, y se clasifica la sangre como Rh positivo variante Du.


En el caso de no existir aglutinación, se clasificará la sangre como Rh negativo.


Para evitar falsos positivos se realiza la prueba de Coombs directa con los hematíes problema. Esto nos sirve como control negativo.



Resultados obtenidos:


No hubo aglutinación, por lo tanto, la sangre es Rh negativo.






Resolución de los objetivos propuestos:


-El suero de Coombs contiene antiglobulina humana de conejo.


-En la prueba directa se detectan anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo.


-En la prueba indirecta podemos detectar anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.


-En la sangre del paciente buscamos la presencia del antígeno D débil.


-Si el control es positivo los resultados del análisis nos dan que la sangre problema es Rh positivo.



Bibliografía:


-www.wikipedia.org




























domingo, 17 de mayo de 2015

Práctica: Determinación de la identidad genética.

Fecha: 13/05/2015.


PRIMERA PARTE DE LA PRÁCTICA: OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.

Introducción:

La muestra para obtener el ADN es de las células de la mucosa bucal (se realiza frontando con una palillo o un hisopo las paredes de la cavidad oral , con cuidado y sin frotar muy fuerte).














Materiales:

-Papel de filtro.

-Palillos o hisopos.

-Tubo de vidrio.

-Microtubos.

-Micropipeta.

-Calentador para eppendorfs.



















-Puntas de micropipeta.

-Vaso de precipitado.

-Pipetas de vidrio graduadas de 5 y de 2 ml.

-Eppendorfs.














-Centrífuga especial.



















-Pipetas Pasteur de vidrio.

-Congelador.


Reactivos:


-Solución salinal al 0,9 %.


















-MATRIZ INSTAGENE.












Muestra:


Según he indicado en la introducción, la muestra es de células de la mucosa bucal.



Procedimiento de la práctica:


1º. Con un palillo frotamos en las paredes de la cavidad oral (ésta debe haber sido enjuagada previamente).












2º. Depositamos el palillo en 3 ml de solución salina al 0,9 % y removemos con el mismo palillo.




















3º. De esa mezcla cogemos 1,4 ml con la pipeta graduada de vidrio de 2 ml. Lo depositamos en un eppendorf.
















4º. Centriguamos a 8.000 r.p.m durante 5 minutos (Recuerda que deben ir enfrentados los eppendorfs).




















5º. Decantar el sobrenadante con cuidado (podemos ayudarnos de una pipeta Pasteur de vidrio).




6º. Añadir 70 microlitros de MATRIZ INSTAGENE (se encarga de romper los orgánulos celulares)  y mover con la punta de la micropipeta.



7º. Incubar 10 minutos a 100 ºC (en el calentador de eppendorfs) y enfriar a temperatura ambiente (Incubamos para que la matriz actúe).



















8º. Centrifugar a 13.000 r.p.m durante 30 segundos (recuerda: siempre hay que enfrentar en la centrífuga).


9º. Pasar 10 microlitros a un microtubo y meter al congelador para conservar.




Fecha: 14/05/2015.



SEGUNDA PARTE DE LA PRÁCTICA: PCR.


Introducción:


En esta parte de la práctica vamos a proceder con la realización de la PCR, es la parte que más nos interesa.


















Materiales:


-Papel de filtro.

-Termociclador (foto superior).

-Frasco lavador.

-Eppendorf (con bolita) = Tubo Ready to go PCR.

-Micropipeta.

-Centrífuga especial.








-Puntas de micropipeta.

-Vaso de precipitado.



Reactivos empleados:


-Oligo 1 y oligo 2.


-Agua destilada.



Muestra:


-2,5 microlitros del ADN que hemos congelado en la primera parte , debemos esperar un rato a que se descongele.



Desarrollo:


1º. En el tubo Ready to go PCR (eppendorf con bolita) añadimos 18,5 microlitros de agua destilada con ayuda de una micropipeta , 2 microlitros de oligo 1 y otros 2 microlitros de oligo 2 (son los primers o cebadores), por último añadimos 2,5 microlitros de la muesta de ADN que se estaba descongelando.


2º. Le damos un golpe de centrífuga ( el objetivo es que bajen las gotitas que se han quedado en las paredes del eppendorf ).

Cuando ponemos la centrífuga a muchas revoluciones es para dejar en el fondo los orgánulos.


3º. Pasar los tubos Ready to go PCR al termocicaldor sin agitarlos n removerlos.


4º. Una vez en el termociclador esperamos a que realice los ciclos.



















Fecha: 15/05/2015.




TERCERA PARTE DE LA PRÁCTICA: PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA Y ELECTROFORESIS.


Introducción:


En esta última parte vamos a realizar la electroforesis para ello, debemos hacer un gel de agarosa adecuado.


































Materiales:


-Papel de filtro.

-Vaso de precipitado.

-Balanza electrónica.

-Vidrio de reloj.

-Cucharilla.

-Microondas.
















-Varilla de vidrio.

-Frasco lavador.

-Probeta.

-Material para electroforesis.

-Portas.

-Micropipeta.

-Matraz aforado de 100 ml.

-Puntas de micropipeta.

-Visualizador.

-Luz ultravioleta (UV).

























Reactivos utilizados:


- Tampón 1xTBE


















-Agua destilada.


-Agarosa.






















-Glicerol al 30 % , debemos hacer los calculos adecuados para hacerlo a esta concentración.



















30 g de glicerol-----------100 ml de disolución
  x g de glicerol----------- 3 ml de disolución  


x = 0,9 g de glicerol.


3 ml de disolución - 0,9 g de glicerol = 2,1 ml de agua destilada.



-Tampones de carga.






























-Colorante de nucleótidos "RedSafe Nucleic Acid Staining Solution" en lugar de Bromuro de Etidio (es cancerígeno).



















Procedimiento para realizar el gel de agarosa:


1º. Pesamos en la balanza electrónica 1,5 g de agarosa, la depositamos en 10 ml de tampón y enrasamos con agua destilada en un matraz aforado de 100 ml.



















2º. Fundir la agarosa completamente en el microondas.


3º. Cuando sale del microondas dejar enfriar y añadir 5 microlitros del colorante de nucleótidos con ayuda de una micropipeta y puntas de micropipeta.



Preparación de la electroforesis:


1º. Depositamos el gel de agarosa con cuidado en la bandeja de elecroforesis  previamente sellada y con cuidado.
















2º. Dejar solidificar aproximadamente 30 minutos.

3º.  Una vez solidificado cubrir con tampón 1xTBE ( Tenemos que diluir al 10 %, por lo tanto añadimos 100 ml de 1xTBE y 900 ml de agua destilada ).

Los pocillos deben estar cerca del cátodo (polo negativo,color negro).

Colocar los cables en la cubeta y en la fuente de electroforesis: cable negro para polo negativo, cable rojo para polo positivo (hacia el que migrará el ADN).


4º. Quitar los peines con cuidado de no romper los pocillos.


5º. Habrá 16 pocillos superiores y 16 pocillos inferiores.


En los 2 pocillos de los extremos superiores y en los 2 de los extremos inferiores debemos colocar el contro.

En la parte superior añadimos 5 microlitros  del tampón de carga de azul de metileno y en los inferiores de otro tampón de carga.


6º. En el resto de los pocillos ponemos 5 microlitros deñ tampón de carga correspondiente y 5 microlitros de la muestra de ADN.

De cada muestra de  ADN hacemos 2 pocillos.



















































7º. Le aplicamos la corriente (70-120 voltios): Puede durar unso 30 minutos a 120 voltios y tapamos.







8º. Una vez finalizada la electroforesis, se visualizan los fragmentos de ADN mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen. (cuidado porque la luz UV puede causar daños en los ojos).

































Bibliografía:


-www.ctr.wib.com

-www.hisop-ie.es

-www.hctr-lab.com