PRIMERA PARTE DE LA PRÁCTICA: OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.
Introducción:
La muestra para obtener el ADN es de las células de la mucosa bucal (se realiza frontando con una palillo o un hisopo las paredes de la cavidad oral , con cuidado y sin frotar muy fuerte).
Materiales:
-Papel de filtro.
-Palillos o hisopos.
-Tubo de vidrio.
-Microtubos.
-Micropipeta.
-Calentador para eppendorfs.
-Puntas de micropipeta.
-Vaso de precipitado.
-Pipetas de vidrio graduadas de 5 y de 2 ml.
-Eppendorfs.
-Centrífuga especial.
-Pipetas Pasteur de vidrio.
-Congelador.
Reactivos:
-Solución salinal al 0,9 %.
-MATRIZ INSTAGENE.
Muestra:
Según he indicado en la introducción, la muestra es de células de la mucosa bucal.
Procedimiento de la práctica:
1º. Con un palillo frotamos en las paredes de la cavidad oral (ésta debe haber sido enjuagada previamente).
2º. Depositamos el palillo en 3 ml de solución salina al 0,9 % y removemos con el mismo palillo.
3º. De esa mezcla cogemos 1,4 ml con la pipeta graduada de vidrio de 2 ml. Lo depositamos en un eppendorf.
4º. Centriguamos a 8.000 r.p.m durante 5 minutos (Recuerda que deben ir enfrentados los eppendorfs).
5º. Decantar el sobrenadante con cuidado (podemos ayudarnos de una pipeta Pasteur de vidrio).
6º. Añadir 70 microlitros de MATRIZ INSTAGENE (se encarga de romper los orgánulos celulares) y mover con la punta de la micropipeta.
7º. Incubar 10 minutos a 100 ºC (en el calentador de eppendorfs) y enfriar a temperatura ambiente (Incubamos para que la matriz actúe).
8º. Centrifugar a 13.000 r.p.m durante 30 segundos (recuerda: siempre hay que enfrentar en la centrífuga).
9º. Pasar 10 microlitros a un microtubo y meter al congelador para conservar.
Fecha: 14/05/2015.
SEGUNDA PARTE DE LA PRÁCTICA: PCR.
Introducción:
En esta parte de la práctica vamos a proceder con la realización de la PCR, es la parte que más nos interesa.
Materiales:
-Papel de filtro.
-Termociclador (foto superior).
-Frasco lavador.
-Eppendorf (con bolita) = Tubo Ready to go PCR.
-Micropipeta.
-Centrífuga especial.
-Puntas de micropipeta.
-Vaso de precipitado.
Reactivos empleados:
-Oligo 1 y oligo 2.
-Agua destilada.
Muestra:
-2,5 microlitros del ADN que hemos congelado en la primera parte , debemos esperar un rato a que se descongele.
Desarrollo:
1º. En el tubo Ready to go PCR (eppendorf con bolita) añadimos 18,5 microlitros de agua destilada con ayuda de una micropipeta , 2 microlitros de oligo 1 y otros 2 microlitros de oligo 2 (son los primers o cebadores), por último añadimos 2,5 microlitros de la muesta de ADN que se estaba descongelando.
2º. Le damos un golpe de centrífuga ( el objetivo es que bajen las gotitas que se han quedado en las paredes del eppendorf ).
Cuando ponemos la centrífuga a muchas revoluciones es para dejar en el fondo los orgánulos.
3º. Pasar los tubos Ready to go PCR al termocicaldor sin agitarlos n removerlos.
4º. Una vez en el termociclador esperamos a que realice los ciclos.
Fecha: 15/05/2015.
TERCERA PARTE DE LA PRÁCTICA: PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA Y ELECTROFORESIS.
Introducción:
En esta última parte vamos a realizar la electroforesis para ello, debemos hacer un gel de agarosa adecuado.
Materiales:
-Papel de filtro.
-Vaso de precipitado.
-Balanza electrónica.
-Vidrio de reloj.
-Cucharilla.
-Microondas.
-Varilla de vidrio.
-Frasco lavador.
-Probeta.
-Material para electroforesis.
-Portas.
-Micropipeta.
-Matraz aforado de 100 ml.
-Puntas de micropipeta.
-Visualizador.
-Luz ultravioleta (UV).
Reactivos utilizados:
- Tampón 1xTBE
-Agua destilada.
-Agarosa.
-Glicerol al 30 % , debemos hacer los calculos adecuados para hacerlo a esta concentración.
30 g de glicerol-----------100 ml de disolución
x g de glicerol----------- 3 ml de disolución
x = 0,9 g de glicerol.
3 ml de disolución - 0,9 g de glicerol = 2,1 ml de agua destilada.
-Tampones de carga.
-Colorante de nucleótidos "RedSafe Nucleic Acid Staining Solution" en lugar de Bromuro de Etidio (es cancerígeno).
Procedimiento para realizar el gel de agarosa:
1º. Pesamos en la balanza electrónica 1,5 g de agarosa, la depositamos en 10 ml de tampón y enrasamos con agua destilada en un matraz aforado de 100 ml.
2º. Fundir la agarosa completamente en el microondas.
3º. Cuando sale del microondas dejar enfriar y añadir 5 microlitros del colorante de nucleótidos con ayuda de una micropipeta y puntas de micropipeta.
Preparación de la electroforesis:
1º. Depositamos el gel de agarosa con cuidado en la bandeja de elecroforesis previamente sellada y con cuidado.
2º. Dejar solidificar aproximadamente 30 minutos.
3º. Una vez solidificado cubrir con tampón 1xTBE ( Tenemos que diluir al 10 %, por lo tanto añadimos 100 ml de 1xTBE y 900 ml de agua destilada ).
Los pocillos deben estar cerca del cátodo (polo negativo,color negro).
Colocar los cables en la cubeta y en la fuente de electroforesis: cable negro para polo negativo, cable rojo para polo positivo (hacia el que migrará el ADN).
4º. Quitar los peines con cuidado de no romper los pocillos.
5º. Habrá 16 pocillos superiores y 16 pocillos inferiores.
En los 2 pocillos de los extremos superiores y en los 2 de los extremos inferiores debemos colocar el contro.
En la parte superior añadimos 5 microlitros del tampón de carga de azul de metileno y en los inferiores de otro tampón de carga.
6º. En el resto de los pocillos ponemos 5 microlitros deñ tampón de carga correspondiente y 5 microlitros de la muestra de ADN.
De cada muestra de ADN hacemos 2 pocillos.
7º. Le aplicamos la corriente (70-120 voltios): Puede durar unso 30 minutos a 120 voltios y tapamos.
8º. Una vez finalizada la electroforesis, se visualizan los fragmentos de ADN mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen. (cuidado porque la luz UV puede causar daños en los ojos).
Bibliografía:
-www.ctr.wib.com
-www.hisop-ie.es
-www.hctr-lab.com
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