Introducción:
La prueba de la sacarosa consiste en situar los eritrocitos problema en un medio de baja fuerza iónica ( por ejemplo: una solución de sacarosa). En este medio, los eritrocitos tienden a fijar el complemento, por lo que cuando los hematíes presentes en la muestra tienen una sensibilidad anormalmente alta al complemento tienden a sufrir la acción de éste y, por tanta, a lisarse (destruirse).
Esta práctica se realiza para diagnosticar a pacientes con HPN (hemoglobinuria paroxística nocturna).
La prueba de la sacarosa es menos específica que la de Ham-Dacie, pero es más sensible y rápida.
Material:
-Tubos de centrífuga (cónicos).
-Papel de filtro.
-Pipetas Pasteur.
-Pipetas graduadas ( 1 de 5 ml y 2 de 2 ml ).
-Micropipeta.
-Puntas de micropipeta.
-Reloj.
-Centrífuga.
-Espectrofotómetro.
-Cubetas para espectrofotómetro.
-Gradilla.
-Rotulador de vidrio.
-Matraz aforado de 100ml.
-Balanza electrónica.
-Vidrio de reloj.
-Cucharilla o espátula.
-Embudo de decantación.
-Papel Parafilm.
-Tubos de ensayo.
-Vaso de precipitado.
-Frasco lavador.
Reactivos:
-Solución acuosa de sacarosa (azúcar común) a una concentración del 9,24 %.
Preparación:
1º Pesamos 9,24 g de sacarosa en un vidrio de reloj previamente tarado.
2º En un vaso de precipitado añadimos un poco de agua destilada y añadimos los 9,24 g de sacarosa.
3º Depositamos la mezcla en un matraz aforado de 100 ml y con agua destilada enrasamos hasta la línea de aforo.
-Sangre control: sangre normal extraída recientemente que sabemos que no tiene hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN).
-Solución acuosa de amoniaco: tienen que ser dilución 1 : 6
1/6 = x / 100 ------> x = 100 /6 = 16,67 g de amoniaco (NH3).
100 ml de disolución - 16,67 g de soluto = 83,33 g de agua destilada.
Preparación:
1º Pesamos en un vaso de precipitado previamente tarado 83,33 g de agua.
2º Añadimos 16,67 g de amoniaco para obtener una disolución de 100 g.
-Suero fisiológico al 0,9 %.
Muestra empleada:
-Sangre venosa anticoagulada con EDTA.
Objetivos de la práctica:
- Decir la solución con la que se hemolizan los hematíes vertidos en el tubo problema.
- Decir a qué concentración se prepara la solución de sacarosa.
- Saber el otro nombre de la sacarosa.
- Saber qué es el ACD.
- Explicar la preparación del tubo blanco.
- Decir qué porcentaje de hemólisis suele producirse, con la prueba de la sacarosa, en la sangre de la HPN (hemoglobinuria paroxística nocturna).
Procedimiento de la práctica:
1. Rotular 3 tubos. Uno con las siglas SF (suero fisiológico), otro con las siglas SC (sangre control) y otro con las siglas SP (sangre problema).
2. LLenar el tubo SF con: 1,8 ml de suero fisiológico con ayuda de una pipeta graduada de 2 ml y añadir también 0,2 ml de sangre problema con una micropipeta.
De el tubo SF vamos a hacer un duplicado para luego a la hora de centrifugar poder enfrentarlos.
3. Llena el tubo SC con: 1,8 ml de solución de sacarosa con ayuda de una pipeta graduada de 2 ml y añadir también 0,2 ml de sangre control con ayuda de una micropipeta.
4. Llena el último tubo, el SP con: 1,8 ml de solución de sacarosa con ayuda de una pipeta graduada de 2 ml y añadir también 0,2 ml de sangre problema con una micropipeta.
5. Agitar suavemente los tubos, no utilizar el agitador, hemolizaríamos la sangre.
6. Dejar los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
7. Centrifugar los tubos a 2.000 rpm durante 5 minutos.
Lectura de resultados:
Puede ser visual o espectrofotométrica.
Visualmente se considera que no hay hemólisis cuando se observa un botón sedimentario rojizo y un líquido sobrenadante incoloro y transparente. Sin embargo, se estima que hay hemólisis cuando se advierte la presencia de un líquido rojizo y transparente. En los tubos SF Y SC no tiene que haber hemólisis , ya que funcionan como controles negativos.
Para la lectura espectrofotométrica, se requiere la preparación de 3 tubos: tubo blanco (TB) , tubo patrón (TP) y tubo problema (TPr).
-El tubo blanco (TB) se llena con: 5 ml de disolución de amoniaco (NH3) con ayuda de una pipeta graduada de 5 ml. A este tubo también se le añade 0,3 ml de suero fisiológico con una micropipeta.
-El tubo patrón (TP) se llena con: 5 ml de disolucón de amoniaco (NH3) con ayuda de una pipeta graduada de 5 ml. Añadimos también 0,3 ml del sobrenadante del tubo SP preparado anteriormente.
-El tubo problema (TPr) se llena con: 5 ml de disolución de amoniaco (NH3) y con 0,3 ml de líquido resuspendido del tubo SF preparado antes.
A continuación, vamos a medir la absorbancia de cada uno de ellso con el espectrofotómetro ajustado a 540 nm.
El líquido del tubo blanco (TB) lo utilizamos para poner el espectrofotómetro a 0 de absorbancia (A), y el líquido del tubo patrón (TP) se utiliza para determinar la absorbancia (A) que corresponde a un 100 % de hemólisis.
En este caso utilizaremos cubetas para el espectrofotómetro que se introducen en la parte interior de éste en dirección a la flecha indicada.
La diferencia con respecto a la otra forma es que al introducir la muestra hay que darle a "Enter" y no a "Pump" como hacíamos antes. Tampoco hay que limpiar el tubo externo.
Resultados obtenidos:
(A) Tubo blanco (TB) = 0
(A) Tubo patrón (TP) = -0,35
(A) Tubo problema (TPr) = -0,033
Después, aplicamos la siguiente fórmula:
% hemólisis = A / AM x 100
A= Absorbancia del líquido presente en el tubo problema (TPr).
AM= Absorbancia del líquido contenido en el tubo patrón (TP).
Cálculos:
% hemólisis = -0,033 / -0,35 x 100 = 9,43 %
Interpretación clínica de los resultados:
La prueba de la sacarosa suele ser positiva en la hemoglobinuria paroxísitaca nocturna (HPN). El grado de positividad que se produce en esta enfermedad oscila entre un 10 y un 80 % de hemólisis.
Esta prueba es menos específica que la de Ham-Dacie para el diagnóstico de la HPN, pero en cambio es más sensible y más rápida que ésta.
La prueba de la sacarosa es siempre negativa en la diseritropoyesis congénita tipo II (HEMPAS).
Valoración de los resultados:
-Los hematíes problema:
No tienen una sensibilidad aumentada al complemento.
-El enfermo:
No padece una HPN.
Resolución de los objetivos propuestos:
-Los hematíes vertidos en el tubo problema (TPr) se hemolizan con la solución de amoniaco (NH3).
-La solución de sacarosa se prepara a una concentración del 9,24%.
-La sacarosa también se llama azúcar común.
-El ACD es el ácido cítrico-dextrosa.
-El tubo blanco (TB) se prepara con 5 ml de solución de amoniaco (NH3) y con 0,3 ml de suero fisiológico.
-En la sangre de la HPN, con la prueba de la sacarosa, suele producirse un porcentaje de hemólisis comprendido entre un 10 y un 80 %.
Observaciones:
En la primera tanda de tubos no era necesario realizar el tubo SC (sangre control) , porque para la lectura espectrofotométrica no nos hace falta la suspensión de ese tubo.
Al haberlo hecho sin ese tubo, no hubiera sido necesario duplicar el tubo SF (suero fisiológico) , porque solo tendríamos 2 tubos para enfrentar.
Bibliografía:
-www.labrec.blogspot.com
-www.bio.lab.exp.com
-www.seismlabor.blogspot.com
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