Introducción sobre la práctica:
La determinación de la hemoglobina en sangre es fundamental para el diagnóstico de las anemias.
Existen varios métodos para su determinación, los más utilizados se fundamentan en la capacidad para absorber luz de la hemoglobina o alguno de sus derivados , como la oxihemoglobina o la cianmetahemoglobina.
La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
Precauciones de seguridad:
El cianuro de potasio: Nocivo (Xn): R26/27/28: Muy tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. R32: En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos.
Peligroso para el medio ambiente (N): R52/53: Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.
S7: Manténgase el recipiente bien cerrado. S28: En contacto con la piel, lavar inmediatamente y abundantemente con agua. S45: En caso de accidente o malestar, acudir inmediatamente al médico. S60: Eliminese el producto y su recipiente como residuos peligrosos. S61: Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas / las fichas de datos de seguridad.
Material necesario:
-Papel de filtro.
-Gradilla.
-Tubos de ensayo.
-Frasco lavador.
-Pipetas Pasteur.
-Micropipetas.
-Puntas de micropipeta.
-Pipetas graduadas.
-Temporizador.
-Cubetas para el espectrofotómetro.
-Espectrofotómetro.
Reactivos:
-Preparar el reactivo de trabajo (RT):
Poner 5 ml de cianuro de potasio en un matraz aforado de 250 ml y enrasar con agua destilada hasta la línea de aforo.
-Patrón para hemoglobina.
Muestras utilizadas:
Nosotros utilizamos sangre venosa anticoagulada con EDTA , pero como hacían falta dos muestras, utilizamos sangre de distintas bolsas.
Objetivos propuestos:
-Decir en qué se basan los métodos de determinación de la hemoglobina.
-Decir cuál es el método recomendado por el Comité internacional para la estandarización de la Hematología.
-Saber de dónde procede el 15 de la fórmula para calcular al concentración.
Desarrollo de la práctica:
1. Rotulamos 5 tubos de ensayo como Blanco de reactivo, Patrón , muestra 1 y muestra 2.
2. En el tubo rotulado Blanco, le añadimos con ayuda de una pipeta graduada 2,5 ml de Reactivo de trabajo (RT).
3. En el tubo rotulado Patrón, le añadimos con ayuda de una pipeta graduada 2,5 ml de Reactivo de trabajo (RT) y con una micropipeta también le añadimos 10 microlitros de Patrón para hemoglobina.
4. A continuación, en el tubo de ensayo rotulado como muestra 1, ponemos 10 microlitros de la primera sangre escogida y 2,5 ml de Reactivo de trabajo (RT).
5. Después, en el tubo rotulado como muestra 2, hacemos lo mismo que para la muestra 1 pero con la segunda sangre escogida.
6. Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente.
7. Por último utilizaremos el espectrofotómetro para calcular la absorbancia del Patrón y de las muestras 1 y 2.
Para calibrar el espectrofotómetro debemos hacerlo diluyendo primero a 1/2 y después a 1/4, añadiendo en un tubo de hemólisis 250 microlitros de patrón de hemoglobina (15g/dl), en el segundo tubo añadiendo 250 microlitros de patrón anterior y 250 microlitros de agua destilada (7,5 g/dl) y en el tercer tubo añadiendo 250 microlitros del tubo anterior y 250 microlitros de agua destilada (3,75 g/dl).
Haciendo todo esto hemos sacado el patrón 1, 2 y 3 , nos servirá en la gráfica de la absorbancia para calcular la concentración de hemoglobina del patrón y de las muestras 1 y 2.
Podemos hacerlo en microlitros o en ml:
250 microlitros = 0,25 ml
De patrón para calibrar hacemos un total de 0,5 ml = 500 microlitos
Para utilizar el espectrofotómetro deberemos aprender la hoja sobre su manejo.
(El Blanco es solo para calibrar el aparato)
Gráfica de la absorbancia:
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Una vez nos han dado los siguientes datos:
-Patrón 1:Concentración de hemoglobina= 15 g/dl y A540= 0,136
-Patrón 2:Concentración de hemoglobina= 7,5 g/dl y A540= 0,069
-Patrón 3:Concentración de hemoglobina= 3,75 g/dl y A540= 0,056
*A540 se refiere al espectrofotómetro.
Gráfica de la absorbancia a ordenador:
En nuestro caso tenemos:
-Patrón 1:Concentración de hemoglobina= 15 g/dl.
CÁLCULO:
La concentración de Hb corresponde al eje "x" y la absorbancia al eje "y", por lo tanto, el patrón 1 nos proporciona el eje "x":
y = 0,0074 x + 0,0225
y = 0,0074*15 + 0,0225 = 0,1335
y = 0,0074 x + 0,0225
y = 0,0074*15 + 0,0225 = 0,1335
-Patrón 2:Concentración de hemoglobina= 7,5 g/dl.
CÁLCULO:
En el patrón 2 nos proporciona también el eje "x":
y = 0,0074 x + 0,0225
y = 0,0074*7,5 + 0,0225 = 0,078
-Patrón 3:Concentración de hemoglobina= 3,75 g/dl
CÁLCULO:
En el patrón 3 nos proporciona el eje "x":
y = 0,0074 x + 0,0225
y = 0,0074*3,75 + 0,0225 = 0,05025
Los resultados obtenidos por la gráfica con el programa informático son más exactos que los que realizamos un poco "a ojo" en la gráfica hecha a mano.
Resultados obtenidos:
Con el espectrofotómetro obtuvimos los siguientes resultados:
Patrón: A540 = 0,090
Muestra 1: A540 = 0,177
Muestra 2: A540 = 0,114
Con estos resultados y con ayuda de la gráfica obtuvimos la concentración de hemoglobina para el patrón y las muestras 1 y 2.
Patrón: Concentración de hemoglobina = 12 g/dl.
Muestra 1: Concentración de hemoglobina = 16 g/dl.
Muestra 2: Concentración de hemoglobina = 14,5 g/dl.
Además de la gráfica también existe una fórmula para calcular la concentración de hemoglobina de cada sustancia:
( (A) Muestra 1 o 2 / (A) Patrón ) x 15
- (A) = Absorbancia de la muestra 1
- 15 = Concentración de hemoglobina del Patrón = g/dl.
Muestra 1: (0,177 / 0,090) x 15 = 29,5 g/dl.
Muestra 2: (0,114 / 0,090) x 15 = 19 g/dl.
Interpretación clínica de los resultados:
Los valores normales son:
Hombres: 14-18 g/dl.
Mujeres: 11-16 g/dl.
Niños: 10-14 g/dl.
Hemos decidido tomar los valores de la gráfica y nos ha salido: 16 g/dl en la muestra 1 y 14,5 g/dl en la muestra 2, por lo que son valores normales dentro de un adulto.
Si nos hubieran salido unos valores por debajo de los valores normales: indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.
Por encima de los valores normales: puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.
Resolución de los objetivos propuestos:
-Los métodos de determinación de la hemoglobina se basan en las propiedades fisico-químicas de la molécula de hemoglobina.
-El método recomendado por el Comité internacional para la estandarización de de la Hematología es el colorimétrico de cianmetahemoglobina.
-El 15 de la fórmula para calcular la concentración procede de la concentración de hemoglobina del patrón 1.
Bibliografía:
-www.materialabobio.blogspot.com
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